人乳頭瘤病毒與胰腺癌關(guān)系的初步探討

劉冬梅 陳少夫

人乳頭瘤病毒與胰腺癌關(guān)系的初步探討

劉冬梅 陳少夫

早在20世紀(jì)90年代初期就已證實，人乳頭瘤病毒(human papillomavirus，HPV)感染與宮頸癌有關(guān)[1]，現(xiàn)又證實HPV還與肛管癌、陰莖癌、口腔咽喉癌、膀胱癌、肺癌、食管癌、結(jié)直腸癌等多種腫瘤相關(guān)[2-5]，但與胰腺癌的關(guān)系尚未見報道。因此，本文研究HPV感染與胰腺癌的關(guān)系。

一、材料與方法

1．組織標(biāo)本：收集2007年1月至2009年12月中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院肝膽胰切除的經(jīng)病理證實的39例胰腺癌石蠟包埋標(biāo)本。患者術(shù)前無明確的HPV相關(guān)疾病感染史，其中男22例，女17例，年齡39～73歲，平均57歲。以已證實存在HPV感染的臨床宮頸拭子組織作為陽性對照。

2．MY/GP巢式PCR擴(kuò)增HPV DNA：取石蠟組織切片，脫蠟至水后，室溫下放置10 min，應(yīng)用基因組DNA提取試劑盒(潮州凱普生物化學(xué)有限公司)提取組織DNA，按說明書操作。參考文獻(xiàn)[6-7]設(shè)計針對HPV相對保守的L1 區(qū)的外引物MY09/11，序列5′-CGTCCMARRGGAWACTGATC-3′，5′-GCMCAGGGWCTATAAYAATGG-3′，擴(kuò)增片段450 bp；內(nèi)引物GP5+/GP6+，序列5′-TTTGTTACTGTGGTAGATACYAC-3′，5′-GAAAAATAAACTGTAAATCATATTC-3′，擴(kuò)增片段140 bp。序列中的M=A/C, R=A/G, W=A/T, Y=C/T。以原癌基因c-kit第17號外顯子為內(nèi)參照，序列5′-TACAAGTTAAAATGAATTTAAATGGT-3′，5′-AAGTTGAAACTAAAAATCCTTTGC-3′，擴(kuò)增片段228 bp。引物均由北京六合華大基因科技股份有限公司合成。應(yīng)用內(nèi)參照引物行PCR擴(kuò)增。PCR條件：95℃ 9 min，95℃ 20 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s，40個循環(huán)，最后72℃ 5 min。參考文獻(xiàn)[8-9]行巢式PCR擴(kuò)增HPV DNA。第一次應(yīng)用MY09/11引物擴(kuò)增，PCR條件：96℃ 5 min，96℃ 45 s，50℃ 45 s，72℃ 60 s，30個循環(huán)，最后72℃ 10 min。再以擴(kuò)增的DNA片段為模板，GP5+/GP6+為引物，行第二次擴(kuò)增，PCR條件：94℃ 5 min，94℃ 30 s，40℃ 45 sec，72℃ 45 s，40個循環(huán)，最后72℃ 10 min。每批次PCR反應(yīng)均包括陽性對照和陰性對照(蒸餾水)，擴(kuò)增產(chǎn)物均行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像分析系統(tǒng)(Tanon GIS-2020)觀察結(jié)果并攝片。

二、結(jié)果

1．人原癌基因的檢測：39例胰腺癌組織均擴(kuò)增出c-kit基因片段(圖1)，證實全部組織標(biāo)本DNA提取成功。

1：陽性對照，2～6：胰腺癌組織

2．HPV基因的檢測：39例胰腺癌組織均未檢測到HPV DNA(圖2)。

1：陽性對照，2：陰性對照，3～5：胰腺癌組織

討論隨著分子生物學(xué)的進(jìn)展，人們越來越發(fā)現(xiàn)人體組織細(xì)胞的程序性死亡或凋亡的時間、速度和數(shù)量均受到基因的嚴(yán)密控制[10]，而腫瘤病毒的DNA、蛋白質(zhì)可能與某些調(diào)控細(xì)胞凋亡的基因DNA片段結(jié)合，干擾這些基因信息的傳遞、轉(zhuǎn)錄、復(fù)制，使其在錯誤的時間和(或)環(huán)節(jié)上調(diào)控細(xì)胞的生命周期，使細(xì)胞不能按正常程序死亡，而向惡性化方向發(fā)展，導(dǎo)致癌的發(fā)生[11]。

研究表明[12]，全世界5.5%的現(xiàn)患癌癥患者與HPV感染有關(guān)。HPV不僅感染某些器官的鱗狀上皮，亦可感染腺上皮[13-15]。在惡性腫瘤中，HPV常以單拷貝或多拷貝整合于宿主細(xì)胞基因組中，引起細(xì)胞特定基因功能的喪失或下調(diào)，成為HPV導(dǎo)致惡性腫瘤的主要機(jī)制[16]。

本實驗檢測39例胰腺癌組織的HPV DNA，結(jié)果均為陰性。本文同時應(yīng)用的以MY09/11為外引物和GP5+/GP6+為內(nèi)引物的巢式PCR擴(kuò)增，可檢測多種HPV型別及其他未鑒定的新型別[13]，操作簡單、敏感性高、特異性強(qiáng),結(jié)果可靠。故本結(jié)果提示人乳頭瘤病毒感染可能與胰腺癌的發(fā)生發(fā)展并無關(guān)系。

但病毒DNA在整合過程中常喪失L1區(qū)而保留E6和E7區(qū)，本文應(yīng)用主要針對L1區(qū)設(shè)計的PCR 引物，可能檢測不到HPV DNA，也可能病毒含量低于PCR檢測的最低值。可見，對病毒整合位點的研究可能更有助于明確HPV與胰腺癌發(fā)生之間的關(guān)系。

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2010-06-01)

(本文編輯：呂芳萍)

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2011.01.023

110022 沈陽，中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院第二消化內(nèi)科

陳少夫，Email:csf196211@yahoo.com.cn