重癥急性胰腺炎患者腸黏膜通透性的高壓液相色譜-示差法檢測

黃宏春 王秀敏 胡琳琳

重癥急性胰腺炎患者腸黏膜通透性的高壓液相色譜-示差法檢測

黃宏春 王秀敏 胡琳琳

腸黏膜屏障功能破壞、腸源性細菌易位是重癥急性胰腺炎(severe acute pancreatitis, SAP)繼發(fā)感染以及引起全身炎癥反應綜合征(SIRS)及多臟器功能不全綜合征(MODS)的主要致病機制[1-3]。但目前尚缺乏檢測SAP腸黏膜屏障功能的有效方法。本文采用高壓液相色譜-示差法檢測SAP患者口服糖分子探針乳果糖(LAC)、甘露醇(MAN)后尿液排泄率比值(LAC/MAN)，評估患者腸黏膜屏障功能，現(xiàn)報道如下。

一、材料和方法

1．研究對象：46例SAP患者均為2008年1月至2009年8月我院住院患者，男33例，女13例，年齡21～77歲，平均(56±14)歲。同時以25例本院健康職工作為健康對照組。SAP診斷符合中華醫(yī)學會消化病分會胰腺病學組制定的標準[4]。

2．腸黏膜屏障功能的檢測：受試者于住院次日晨起排空尿液后空腹經胃腸減壓管注入糖溶液(100 ml雙蒸水,5 g甘露醇,10 g乳果糖)。收集6 h尿液，計總量；取10 ml加少量防腐劑(硫柳汞：0.2 mg/ml)，置離心管，封口，-85°C保存待測。參考文獻[5]，采用高壓液相色譜儀(日本島津公司，LC-6A，配備RID-6A示差檢測器)檢測SAP患者尿液LAC/MAN，評估患者腸黏膜通透性。色譜條件：色譜柱為Nucleosil(美國)NH2柱，10 μm (4.6 mm×250 mm id)；流動相為乙腈-水(70∶30，v/v)，流速1 ml/min；柱溫35℃；示差檢測器內加熱溫度為37℃，時間常數(shù)為1.0。

將冰凍貯存樣品解凍、混勻，取5 ml 3000 r/min離心10 min，取上清液3 ml加5%醋酸2～3滴加熱煮沸，冷卻后再5000 r/min離心10 min，取上清液2 ml經陰陽離子交換樹脂去除離子、0.22 μl濾器過濾后，取0.2 ml尿樣品從進樣口注入HPLC儀，由切換閥自動進樣20 μl；當聽到進樣的聲音以后立即開始記錄，直至待測峰全部出現(xiàn)、基線平穩(wěn)后停止記錄。

以同樣處理后的正常尿液，加入5、10、25、50、100、200、500、1000 μg/ml的LAC和MAN。每樣濃度進樣3次。根據(jù)峰面積(R)與相應的濃度(C)進行線性回歸，得回歸方程。依據(jù)樣本的R計算C。

二、結果

標準溶液及樣本的色譜圖見圖1。

a:標準溶液；b:標本；1:甘露醇；2：乳果糖

對照組尿液LAC%、MAN%及LAC/MAN值的變化分別為(0.175±0.010)%、(8.37±0.70)%及0.022±0.003；SAP患者分別為(0.719±0.04)%、(7.41±0.44)%及0.101±0.005。SAP患者尿液LAC%、LAC/MAN比值均顯著高于健康對照組(P值均<0.001)。

討論腸黏膜通透性是指腸黏膜上皮容易被某些分子物質以簡單擴散的方式通過的特性[3]。多項動物實驗和臨床研究均證實，在多種急危重病狀態(tài)下，腸黏膜通透性是增加的，且往往與病情輕重相關[1-3]。

目前臨床和實驗研究中用于測定腸黏膜通透性的分子探針主要有以下幾類：糖分子探針、同位素探針、聚乙二醇類分子探針(PEGS)[5-6]，其中測定LAC/MAN值是一種無創(chuàng)有效的方法，并可排除一些非特異因素，如胃排空、腸蠕動、腸黏膜表面積、心排出量和腎清除能力的影響，是目前公認的檢測腸黏膜通透性較好的方法。一般認為，LAC的通透性可反映腸黏膜的屏障功能，而MAN主要反映腸道的表面積[5-7]。

本試驗結果顯示，SAP患者LAC排泄率顯著升高，MAN排泄率無明顯改變。提示SAP可導致腸壁黏膜水腫，細胞間緊密連接發(fā)生水腫，與近期的動物實驗結果相符[7]。

雙糖試驗的方法有很多。薄層色譜法是一種耗時、半定量的方法；氣-液色譜法需要復雜的柱前衍生；高壓液相色譜法省時，穩(wěn)定性好，可靠性高，儀器較普及，易于推廣[8]。本結果亦證實高壓液相色譜法進行雙糖試驗是檢測SAP患者腸黏膜通透性有效、可靠的方法。

[1] 程禮, 王興鵬, 汪佩文, 等. 保護腸屏障功能對重癥急性胰腺炎患者預后的影響. 胃腸病學,2005,10: 24-26.

[2] 王興鵬, 龔自華.急性胰腺炎的發(fā)病機制新概念∥王興鵬.現(xiàn)代胃腸病學.上海: 上?？茖W技術文獻出版社,2001：90-108.

[3] 武金寶,王繼德,張亞歷.腸粘膜屏障研究進展.世界華人消化雜志,2003,11:619-623.

[4] 中華醫(yī)學會消化病學分會胰腺疾病學組.中國急性胰腺炎診治指南(草案).胃腸病學,2004,9; 110-112.

[5] Kazunori M, Ross B, David M, et al. Rapid and simultaneous quantification of rhamnose mannitol and lactulose in urine by HPLC for estimating intestinal permeability in pediatric practice. Clinicl Chem,1996,42: 71-75.

[6] 王興鵬.急性胰腺炎實驗與臨床研究現(xiàn)狀∥袁耀宗, 王興鵬.胰腺病學新進展與新技術.上海: 上?？茖W技術文獻出版社,2001:106-127.

[7] 谷俊朝,周曉娜,王拒,等.谷氨酞胺對重癥急性胰腺炎大鼠腸道損傷影響的實驗研究.中華肝膽外科雜志,2006,12,757-760.

[8] 鄧高月，劉振邦，徐燕英，等.高壓液相用于腸通透性的測定.中國微生態(tài)雜志,2000,12：242-244.

2009-10-09)

(本文編輯：屠振興)

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2011.01.020

455000 安陽，河南省安陽市人民醫(yī)院消化內科