沙利度胺對大鼠急性壞死性胰腺炎保護作用的實驗研究

祝建紅 陳衛昌 葉建新

·論著·

沙利度胺對大鼠急性壞死性胰腺炎保護作用的實驗研究

祝建紅 陳衛昌 葉建新

目的探討沙利度胺對大鼠急性壞死性胰腺炎(ANP)的保護作用及機制。方法54只SD大鼠按數字表法隨機分成ANP組、沙利度胺組和對照組，每組18只。采用5%牛磺膽酸鈉胰膽管逆行注射方法建立ANP模型。沙利度胺組于建模后1 h予沙利度胺200 mg/kg體重灌胃。術后3、6、12 h分批處死大鼠，觀察腹水量；ELISA法檢測血清TNF-α、IL-6、IL-18水平；流式細胞術檢測外周血CD4+、CD8+T細胞比例； RT-PCR法檢測胰腺組織TNF-α mRNA表達；免疫組化法檢測胰腺組織細胞間黏附分子1(ICAM-1)蛋白表達；行胰腺常規病理檢查。結果術后6 h，對照組的腹水量，血清TNF-α、IL-6、IL-18水平和CD4+、CD8+T細胞比例，胰腺組織TNF-α mRNA及CAM-1蛋白表達，病理評分分別為(1.03±0.31)ml、(57.17±11.29)pg/ml、(24.45±4.14)pg/ml、(64.23±21.85)pg/ml、(47.58±9.21)%、(40.88±2.96)%、0.07±0.02、0.57±0.30、0.67±0.81；ANP組分別為(3.63±0.38)ml、(107.54±33.05)pg/ml、(47.30±11.40)pg/ml、(367.76±108.43)pg/ml、(54.90±7.15)%、(17.17±3.12)%、0.65±0.26、3.20±0.57、11.50±1.87；沙利度胺組分別為(1.45±0.53)ml、(80.60±20.48)pg/ml、(26.61±10.85)pg/ml、(321.82±85.20)pg/ml、(29.80±2.19)%、(15.52±1.96)%、0.35±0.23、2.37±0.67、8.00±3.03。ANP組除CD8+T細胞比例顯著降低外，其余指標均較對照組顯著增加(P值均<0.05)。沙利度胺組指標均顯著低于ANP組(P值均<0.05)。結論沙利度胺能通過抑制TNF-α表達，減少炎癥遞質的釋放，從而減輕ANP大鼠的胰腺病理損害。

胰腺炎，急性壞死性； 腫瘤壞死因子α； 細胞間黏附分子； 大鼠； 沙利度胺

近年來，炎癥介質和細胞因子學說在重癥急性胰腺炎(SAP)發病機制中的作用越來越受到重視[1]。研究表明，急性胰腺炎(AP)本質上是全身炎癥反應綜合征(SIRS)[2]。TNF-α在機體的炎癥反應中處于始動地位，對細胞因子的級聯釋放具有重要意義，起到"扳機"樣作用，是評估SAP預后的主要指標[3]。沙利度胺是谷氨酸衍生物，具有免疫調節、抑制TNF-α及非特異性抗炎作用，廣泛應用于多種臨床免疫性疾病的治療[4]。本實驗觀察沙利度胺對急性壞死性胰腺炎(ANP)大鼠的保護作用，探討其作用機制。

材料及方法

一、實驗動物及分組

健康SD大鼠54只，雌雄不限，清潔級，體重250～300 g，由蘇州大學醫學院實驗動物中心提供。按數字表法隨機分為ANP組、沙利度胺組和對照組。采用膽胰管逆行注入4%牛磺膽酸鈉(Solarbio公司) 0.1 ml/100 g體重方法建立ANP模型。沙利度胺組于建模后1 h給予沙利度胺(25 g溶于500 ml橄欖油)200 mg/kg體重灌胃。對照組只開腹翻動胰腺后隨即關腹。術后3、6、12 h每組各處死6只大鼠。心臟穿刺取血。取胰腺組織，一部分常規固定，石蠟包埋；一部分液氮凍存。

二、檢測指標

1．血清TNF-α、IL-6、IL-18檢測：新鮮血液經 3500 r/min 4℃離心10 min分離血漿，-20℃保存。應用ELISA法檢測血清TNF-α、IL-6、IL-18水平。試劑盒均購自上海西唐生物科技有限公司，按說明書操作。

2．外周血CD4+、CD8+T細胞檢測：取專用試管3支，加入大鼠外周血標本100 μl，分別加入CD3-FITC/ICOS-PE、CD4-FITC/CD8-PE單克隆雙色抗體5 μl，充分混勻，室溫避光下孵育15 min，然后每管加入10×FACS(紅細胞裂解液)2 ml，充分混勻，室溫避光下溶血10 min至完全透明，1500 r/min離心10 min，棄上清液，PBS洗滌3次，每管加入0.5 ml PBS液懸浮，混勻放置室溫下，用美國Beckman公司生產的流式細胞儀測定。

3．腹水觀察：開腹后觀察腹水性質，用稱重的無菌紗布塞入大鼠腹腔約5 min，根據紗布重量的變化大體估算腹水量。

4．胰腺組織的病理檢查：觀察胰腺組織大體病理變化后，石蠟包埋，常規切片、HE染色。由2位病理科醫師按Schmidt等[5]描述的組織學病理分級法盲法評分。

5．胰腺組織TNF-αmRNA表達的檢測：用半定量RT-PCR法檢測。取液氮凍存胰腺組織，用Trizol(美國Invitrogen公司)試劑一步法抽提胰腺樣品總RNA。先逆轉錄為cDNA，再PCR擴增。TNF-α上游序列5′-CCAACAAGGAGGAGGAGAAGT-3′，下游序列5′-GTATGAAGTGGCAAATCG-3′，擴增片段323 bp；內參β-actin上游序列5′-CACGATGGAGGGGCC-GGACTCATC-3′，下游序列5′-TAAAGACCTCTATGCCAACACAGT-3′，擴增片段241 bp。PCR退火溫度54℃，38個循環。擴增產物經電泳分離，掃描，以目的條帶與β-actin條帶的灰度比值作為mRNA的表達量。

6．胰腺組織細胞間黏附分子-1(ICAM-1)蛋白檢測：采用常規免疫組化染色法。以細胞膜或胞質內呈現棕黃色顆粒為陽性。隨機觀察5個具有代表性的高倍視野，計算陽性細胞占總細胞數的百分比，<5%計0分， 5%～25%計1分， 26%～50%計2分，51%～75%計3分，>75%計4分。

結 果

一、血清TNF-α、IL-6、IL-18水平及外周血CD4+、CD8+T細胞亞群比例變化

ANP組大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-18水平均較對照組明顯升高；沙利度胺組大鼠血清TNF-α和IL-6水平于造模后6 h、IL-18水平于造模后12 h較ANP組明顯下降(P值均<0.05，表1)。

ANP組CD4+T細胞比例在造模后3、6 h較對照組顯著增高,而12 h時顯著降低；CD8+T細胞比例在造模后6、12 h較對照組顯著下降(P值均<0.05)。沙利度胺組CD4+T細胞比例在6 h時較ANP組顯著下降，而在12 h時顯著增高；CD8+T細胞在12 h時顯著增高(P值均<0.05，表1)。

表1 各組大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-18水平及CD4+、CD8+ T細胞亞群比例

注：與對照組比較，aP<0.05；與ANP組比較，bP<0.05

二、腹水量及胰腺病理組織學改變

對照組大鼠造模后3、6、12 h腹水量分別為(0.78±0.39)、(1.03±0.31)、(1.15±0.53)ml；ANP組分別為(2.33±0.66)、(3.63±0.38)、(5.43±1.53)ml，沙利度胺組分別為(1.78±0.45)、(1.45±0.53)、(1.53±0.60)ml。ANP組各時點均較對照組明顯增加(P值均<0.05)；沙利度胺組6、12 h點較ANP組明顯減少(P值均<0.05)，而與對照組無明顯差異。對照組大鼠胰腺無明顯病理學改變；ANP組大鼠胰腺組織大片出血壞死，小葉結構破壞，大量炎細胞浸潤；沙利度胺組大鼠胰腺組織病理組織學改變較ANP組明顯減輕(圖1)。對照組、ANP組、沙利度胺組造模后6、12 h病理評分分別為0.67±0.82、11.50±1.87、8.00±3.03；0.50±0.55、12.00±3.23、8.23±3.25。三組間差異均具有統計學意義(P值均<0.05)。

三、胰腺組織TNF-α mRNA及ICAM-1蛋白表達的變化

ANP組各時間點大鼠胰腺組織TNF-αmRNA表達均較對照組明顯增高(P<0.05)；沙利度胺組則較ANP組顯著降低(P值均<0.05，表2)。ANP組各時間點大鼠胰腺組織ICAM-1蛋白表達均較對照組明顯增高，而沙利度胺組6 h的ICAM-1蛋白表達較ANP組顯著降低(P值均<0.05，表2)。

圖1對照組(a)、ANP組(b)、沙利度胺組(c)大鼠胰腺組織病理變化(HE ×100)

組 別時點只數TNF-αmRNAICAM-1蛋白對照組3h60.05±0.020.47±0.35ANP組60.96±0.24a2.30±0.817a沙利度胺組60.31±0.15ab2.02±0.567a對照組6h60.07±0.020.57±0.294ANP組60.65±0.26a3.20±0.566a沙利度胺組60.35±0.23ab2.37±0.674ab對照組12h60.06±0.030.60±0.473ANP組60.30±0.23a2.60±0.748a沙利度胺組60.08±0.04b2.00±0.566a

注：與對照組比較，aP<0.05；與ANP組比較，bP<0.05

討 論

TNF-α能作用于多種細胞，在細胞和亞細胞水平上激發一系列級聯反應[6]。IL-6是炎癥反應中的重要介質，參與急性相反應誘導ICAM-1和血管細胞黏附分子(VCAM)的表達，導致炎癥進展，并且可直接作用于血管內皮細胞，使其通透性增加，導致大量炎性滲出。IL-6與TNF-α等協同，構成炎癥介質網絡。本實驗結果顯示，ANP大鼠在造模后3 h血清TNF-α水平即顯著升高，胰腺組織TNF-α mRNA表達也明顯增高。同時，IL-6水平隨著時間的推移逐漸升高，表明TNF-α在機體的炎癥反應中處于始動地位，促進炎癥細胞的遷移，并刺激靶細胞產生IL-6等炎癥因子，引起連鎖和放大反應。

Moreira等[7]報道，沙利度胺可抑制由脂多糖(LPS)誘導的TNF-α的產生，從而抑制炎癥反應。給大鼠注射致死劑量的LPS前先給予該類似物，可明顯地抑制內毒素性休克。本結果顯示，沙利度胺組在造模后3 h血清TNF-α水平即明顯降低，6 h后IL-6水平明顯降低，表明沙利度胺能抑制ANP時TNF-α的表達，進而降低IL-6分泌，從而緩解胰腺的局部炎癥反應。

IL-18是由庫否細胞及活化的巨嗜細胞產生，能在內毒素血癥時刺激機體產生IFN-γ[8]。Ueda等[9]研究表明，IL-18在AP并發多臟器功能衰竭的患者中顯著升高，阻斷IL-18是治療SAP并發多臟器功能衰竭的重要途徑。本實驗結果顯示，沙利度胺組血清IL-18水平較ANP組下降，其中12 h時差異具有統計學意義。文獻報道，IL-18的表達和ICAM-1的表達具有相關性，并參與了SAP并發多臟器功能衰竭[10]。本結果也顯示沙利度胺治療后胰腺ICAM-1表達減少，提示沙利度胺不但能抑制胰腺局部的炎癥反應，還能通過抑制全身炎癥反應減輕多臟器功能的損害。

Ueda等[11]研究還發現，SAP患者入院后14 d時的CD4+和CD8+T細胞數量減低和繼發感染相關。本實驗中，沙利度胺組12 h的CD4+和CD8+T細胞數量均較ANP組增加，表明沙利度胺對AP時的免疫紊亂具有一定的調節作用，從而減少繼發感染的發生。

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[11] Ueda T,Takeyama Y,Yasuda T,et al.Immunosuppression in patients with severe acute pancreatitis.J Gastroenterol,2006,41:779-784.

2010-05-12)

(本文編輯：屠振興)

Protectiveeffectsofthalidomideonratswithacutenecrotizingpancreatitis

ZHUJian-hong,CHENWei-chang,YEJian-xin.

DepartmentofGastroenterology,FirstAffiliatedHospitalSoochowUniversity,Soochow215006,China

Correspondingauthor:Chenwei-chang,Email：weichangchen@126.com

ObjectiveTo investigate the protective effects of thalidomide on rats with acute necrotizing pancreatitis (ANP) and its mechanism.MethodsFifty four SD rats were randomly divided into the three groups: ANP group, thalidomide group and control group with 18 rats in each group. The model of ANP was induced by retrograde injection of 5% sodium taurocholate into the bili-pancreatic duct. Rats in thalidomide group

thalidomide 200 mg/kg body weight gastric lavage 1 h after ANP induction. The rats were sacrificed 3 h, 6 h, and 12 h after ANP induction, and the amount of intraperitoneal ascites was quantified. The serum levels of TNF-α, IL-6, IL-18 were measured by ELISA. The proportion of CD4+T cell, CD8+T cell in peripheral blood was determined by flow cytometry. The expression of TNF-α mRNA in pancreatic tissue were measured by RT-PCR．The expression of ICAM-1 protein in pancreatic tissue was measured by immunohistochemistry. Pancreatic tissue underwent pathologic examination.ResultsSix hours after surgery, the amount of ascite, serum levels of TNF-α, IL-6, IL-18, CD4+T cell, CD8+T cell, pancreatic TNF-α mRNA and ICAM-1 protein expression, pathologic score in control group was (1.03±0.31)ml, (57.17±11.29)pg/ml, (24.45±4.14)pg/ml, (64.23±21.85)pg/ml, (47.58±9.21)%, (40.88±2.96)%, 0.07±0.02, 0.57±0.30, 0.67±0.81, respectively, and the corresponding values were (3.63±0.38)ml, (107.54±33.05)pg/ml, (47.30±11.40)pg/ml, (367.76±108.43)pg/ml, (54.90±7.15)%, (17.17±3.12)%, 0.65±0.26, 3.20±0.57, 11.50±1.87 in ANP group; and (1.45±0.53)ml, (80.60±20.48)pg/ml,(26.61±10.85)pg/ml, (321.82±85.20)pg/ml, (29.80±2.19)%, (15.52±1.96)%, 0.35±0.23, 2.37±0.67, 8.00±3.03. Besides the value of CD8+T cell was significantly decreased, all other values were significantly increased when compared with control group (P<0.05).ConclusionsThalidomide can decrease the release of inflammatory mediator, and reduce the pathological damage of pancreas of ANP rats by inhibiting TNF-α mRNA expression．

Pancreatitis,acute necrotizing; Tumor necrosis factor-alpha; Intercellular adhesion molecules; Rat; Thalidomide

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2011.03.018

215006 江蘇蘇州 蘇州大學附屬第一醫院消化科(祝建紅：現工作于常熟市第一人民醫院)

陳衛昌，Email：weichangchen@126.com