人參皂苷Rf的分離提純

李 鵬 飛， 何 丹， 魚 紅 閃， 金 鳳 燮

（大連工業大學 生物工程學院，遼寧 大連 116034）

0 引 言

人參皂苷Rf具有抗腫瘤，抗疲勞的功效，能夠減少子宮收縮，且起到與腦神經細胞有關聯的鎮痛作用［1］。人參皂苷Rf是人參中的特有皂苷［2］，常用來作為區分人參與西洋參、三七參等其他類別人參的重要指標［3-4］。因此，制備可作為對照品的人參皂苷Rf單體對鑒別人參藥材具有重要意義。由于Rf這些特殊的性質，將其從人參總皂苷中分離提純進行單獨研究是非常必要的。本實驗室先后對人參皂苷單體Re、Rg1進行了分離，但從未對人參皂苷單體Rf進行過研究。本論文采用甲醇浸提法提取人參根須中總皂苷，然后用硅膠柱層析法分離出人參皂苷Rf單體，為工業上大規模提取人參皂苷Rf提供了實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材 料

人參，人參皂苷標準品，薄層層析板Silica Gel-60-F254，層析用硅膠，高效液相色譜儀；色譜所用試劑為色譜醇，其他實驗試劑均分析醇。

1.2 方 法

1.2.1 人參總皂苷的提取

將1 000g人參根須粉碎后用甲醇反復浸泡3次，過夜，每次甲醇用量為6L。合并浸提液濃縮干燥后用200 mL 石油醚反復脫脂3 次，脫脂后粉末溶解于適量去離子水中，然后用200mL水飽和正丁醇萃取3次，合并正丁醇層。水洗正丁醇層脫糖，最后將正丁醇層濃縮、干燥、收集、稱重，得人參總皂苷。取少量干燥樣品進行HPLC檢測。

1.2.2 硅膠柱層析法

制備樣品膠：將分離所得人參總皂苷用甲醇和少量氯仿溶解，加入2.5 倍樣品質量的80～100目硅膠，水浴蒸干，將樣品膠放入干燥皿中。

裝柱：取20倍人參總皂苷樣品質量的300～400目硅膠作為分離膠，用漏斗慢慢裝入玻璃柱內，使其鋪放均勻（其間抽實硅膠），再裝入樣品膠，最后在最上層放置脫脂棉，裝柱完成。

洗脫：用純氯仿通柱，再用V （氯仿）∶V（甲醇）=8.5∶1.5的氯仿-甲醇洗脫液進行洗脫，待檢測出Rf完全分離后將洗脫液配比換為V（氯仿）∶V（甲醇）∶V（水）=7∶3∶0.5繼續洗脫。最后收集洗脫液，濃縮，蒸干得固體粉末。

1.2.3 薄層層析法（TLC）

分別取1mg人參皂苷標準品及人參皂苷樣品溶于1mL 甲醇中，制成人參皂苷溶液。將點好樣品的薄層板放入層析缸中展開，展開劑配比為V（氯仿）∶V（甲醇）∶V（水）=7∶2.5∶0.5，顯色劑為10%硫酸。根據標準品對照即可確定樣品中的皂苷成分。

1.2.4 高效液相色譜法檢測分離產品純度

高效液相色譜，Waters 2695；色譜柱，Knauer（5μm，250mm×3mm）；流動相A，乙腈；流動相B，水。流動相配比如表1 所示。配置樣品質量分數為2%，用0.45μm 濾膜過濾后即得檢測樣品。柱溫，35 ℃；進樣量，10μL；檢測波長，203nm；體積流量，0.6mL／min。

表1 HPLC檢測的流動相條件Tab.1 Condition of mobile phase of HPLC

2 結果與討論

2.1 提取人參根須總皂苷及其成分分析

按“1.2.1”提取人參總皂苷。將500g人參根須經甲醇浸泡提取，石油醚脫脂，正丁醇萃取，水洗脫糖后干燥稱重，得人參總皂苷干燥粉末20.5g，提取率為4.10%。取干燥樣品2mg，溶于1mL甲醇中進行HPLC檢測，檢測結果如圖1所示。由圖1可知人參根須總皂苷中含有人參皂苷Rg1、Re、Rf、Rb1、Rc、Rb2、Rd，質 量 分 數 分 別 為43.7%、2.68%、9.02%、14.0%、13.1%、10.4%、7.11%。總皂苷中Rf質量分數較高，可進行分離提純。

圖1 人參總皂苷HPLC檢測圖譜Fig.1 Ingredients of total ginsenoside on HPLC

2.2 硅膠柱分離人參總皂苷中的Rf

采用硅膠柱層析法分離上述人參總皂苷中Rf單體。稱取20.5g人參總皂苷樣品，按方法“1.2.2”分離，洗脫液開始配比為V（氯仿）∶V（甲醇）=8.5∶1.5。洗脫液分瓶收集，每瓶體積為200mL，分瓶取樣進行TLC 檢測。待洗脫至55瓶時，Rf洗脫完全。洗脫液配比改為V（氯仿）∶V（甲醇）∶V（水）=7∶3∶0.5。進行TLC檢測，前64瓶TLC檢測結果如圖2所示。

圖2 人參總皂苷硅膠柱分離成分TLC檢測結果Fig.2 The total gingenoside separated by silica gel column on TLC

根據TLC檢測結果，對含有相同組分的收集液進行合并處理，分別用旋轉蒸發儀濃縮，水浴蒸干，稱重，放入干燥的容器中保存。取少量蒸干后的樣品，加入少量的甲醇溶解，再次進行TLC 檢測，結果如圖3所示。在硅膠柱層析分離中，1～17瓶中，除7、8瓶其他均無皂苷洗脫出來，所以TLC檢測無皂苷條紋顯示。人參總皂苷各洗脫組分收集情況見表2。由表2可知，20.5g人參根須總皂苷經硅膠柱分離后，得到較純人參皂苷單體Rf 0.410g，在總皂苷中的得率為2.05%，在人參根須中總得率為0.082%。同時得到副產物人參皂苷單體Rg11.64g，得率為8.20%；皂苷Ra組0.350g，得率為1.75%。

圖3 合并樣品的TLC圖譜Fig.3 The collected total ginsenoside on TLC

表2 人參總皂苷洗脫收集表Tab.2 Prepare for separation by silica gel column

2.3 HPLC檢測分離人參皂苷單體的純度

采用HPLC 方法檢測分離后的人參皂苷Rf純度。精密稱取前上述分離獲得的人參皂苷單體Rf、Rg1及皂苷Ra組各2mg，分別溶于1mL 色譜甲醇，過濾得2mg／mL的供試品。人參皂苷單體Rf的HPLC檢測圖譜如圖4所示。

圖4 人參皂苷Rf的HPLC圖譜Fig.4 Ginsenoside Rf on HPLC

由圖4可以看出，人參根須總皂苷經硅膠柱層析分離得到的人參皂苷Rf單體純度較高，可達到93.0%。同時檢測副產物Rg1純度為81.0%，Ra組純度為61.0%。

3 結 論

從500g人參根須分離提取得到20.5g人參總皂苷，提取率為4.10%，其中人參皂苷Rf的質量分數為9.02%。硅膠柱分離得到人參皂苷單體Rf 0.410g，在總皂苷和人參根須中的得率分別為2.00%和0.082%。同時得到人參皂苷Rg11.64g（8.20%）；皂苷Ra組0.350g（1.75%）。經檢測人參皂苷單體Rf的純度為93.0%，副產物Rg1純度為81.0%，Ra組純度為61.0%。經分離后得到的Rf純度較高，可為以后對Rf這種人參特有皂苷進行單獨研究打下基礎，并為工業上大規模提取人參皂苷Rf提供理論依據。

［1］金鳳燮.天然產物生物轉化［M］.北京：化學工業出版社，2009，84：90-91.

［2］竇德強，靳玲，陳杰英.人參的化學成分及藥理活性的研究進展與展望［J］.沈陽藥科大學學報，1999，16（2）：15.

［3］何耀慧，林榮鋒，陳劍平，等.人參、三七在復方芪術調經散中的高效液相色譜法鑒別［J］.廣州中醫藥大學學報：自然科學版，2009，26（5）：468-470.

［4］李麗，劉春明，吳巍，等.高效液相色譜-電噴霧質譜聯用法測定人參和西洋參的皂苷類成分［J］.分析化學研究報告，2005，33（8）：1087-1090.