菜籽多糖WPS－1對小鼠腹腔巨噬細胞免疫功能的影響

朱建飛 唐春紅 吳謀成

(重慶工商大學環境與生物工程學院1，重慶 400067)

(重慶工商大學綠色食品研究所2，重慶 400067)

(華中農業大學食品科學技術學院3，武漢 430070)

菜籽多糖WPS－1對小鼠腹腔
巨噬細胞免疫功能的影響

朱建飛1，2唐春紅1，2吳謀成3

(重慶工商大學環境與生物工程學院1，重慶 400067)

(重慶工商大學綠色食品研究所2，重慶 400067)

(華中農業大學食品科學技術學院3，武漢 430070)

采用MTT法檢測細胞的活性，菜籽多糖WPS－1能促進巨噬細胞增殖，并表現出明顯的劑量－效果關系，WPS－1促進巨噬細胞增殖的最佳質量濃度為40 μg/mL。采用半定量RT－PCR進一步研究不同作用時間下40 μg/mL WPS－1對腹腔巨噬細胞IL－6、腫瘤壞死因子α(TNF－α)這兩種細胞因子以及誘生型一氧化氮合酶(iNOS)mRNA表達的影響。WPS－1促進腹腔巨噬細胞IL－6、TNF－α和iNOS mRNA表達的最佳時間為24 h。菜籽多糖對巨噬細胞的免疫功能具有調節作用。

菜籽多糖 巨噬細胞 免疫作用

巨噬細胞是機體免疫體系中重要的免疫效應細胞。激活的巨噬細胞是宿主抵抗腫瘤的重要因素，在其中，激活的巨噬細胞分泌IL－1、IL－6、IL－12、TNF－α等細胞因子，這些細胞因子直接參與巨噬細胞介導的殺傷腫瘤細胞的作用［1－3］。激活的巨噬細胞增加iNOS的表達，iNOS催化產生大量的NO，NO是介導巨噬細胞殺傷腫瘤的中心分子［4］。近年來，大量藥理及臨床研究表明，多糖類化合物是一種免疫調節劑，它能激活免疫受體、提高機體的免疫功能［5］。激活巨噬細胞是其發揮免疫調節作用的重要途徑之一［6］。通過研究WPS－1對小鼠腹腔巨噬細胞的影響，檢測WPS－1對巨噬細胞增殖活性的作用，并采用RT－PCR法檢測了對腹腔巨噬細胞分泌的細胞因子IL－6和TNF－α的影響，同時檢測WPS－1在mRNA水平對iNOS的調節作用。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

“雙低”品種華雜4號菜籽冷榨粕:湖北華益油料科技公司;巰基乙醇、青霉素、鏈霉素、脂多糖(LPS)、刀豆球蛋白A(ConA):美國Sigma－Aldrich公司;RPMI－1640細胞培養基:美國Gibco公司;二乙基焦磷酰胺(DEPC)、RNA酶抑制劑(RNasin)、Taq DNA聚合酶:加拿大BBI公司;胎牛血清:杭州四季青生物工程材料公司提供;Trizol試劑:美國Invitrogen公司;M－MLV逆轉錄酶:美國MBI公司;Oligo(dT)15、三磷酸脫氧核糖核苷(dNTP)、引物合成:上海生工生物工程技術服務公司;BALB/c雄性小鼠:SPF級，體重(20±2)g，湖北省醫學科學院實驗動物中心。

SL2300型二氧化碳培養箱:美國Sheldon公司;24孔細胞培養板:美國Corning公司;0.22 μm 微孔濾膜:上海半島公司凈化器材廠;DFC300FX型倒置熒光顯微鏡:德國Leica公司;UV－9100型紫外可見分光光度計:北京瑞利分析儀器公司;PTC－100型PCR儀:美國MJ公司;JS－300型圖像分析系統:上海培清科技公司;ELX 800型全自動酶標分析儀:美國Bio－Tek公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 菜籽多糖提取及純化工藝路線

脫脂菜籽粕，用熱水按最佳工藝流程提取［7］。得到的水溶性多糖提取液用篩選出的特1號大孔吸附樹脂進行初步純化［8］，以去除溶液中的游離蛋白及酚類等色素物質。流出液經真空濃縮，再通過分步醇沉以及DE－52纖維素離子交換柱層析工藝［9］，得到菜籽多糖WPS－1，純度89.3%。

1.2.2 腹腔巨噬細胞的分離

手術刀、解剖剪、解剖鑷、止血鉗等手術器械等需經消毒處理;分離巨噬細胞的方法如下［10］:(1)以頸椎脫臼法處死小鼠，用70%乙醇浸濕小鼠全身。將其仰臥放置，四肢展開釘在木板上;(2)在腹股溝區做一橫切口，撕裂皮膚以完全暴露腹腔，用70%乙醇沖洗腹壁;(3)用注射器先抽1 mL消毒的空氣和4 mL預冷至4℃的培養液，用鑷子提起腹壁，從腹部左側向腹腔中注射;(4)叩打腹壁2 min，使培養液散布于整個腹腔，并促使巨噬細胞從腹腔的漿膜表面釋放，形成細胞懸液;(5)另取一支注射器，從腹部右側進針，抽出懸液，移入預冷的容器中;(6)計數細胞。

1.2.3 巨噬細胞的純化

根據巨噬細胞黏附能力強、貼壁快的特點，采用差速黏附法純化巨噬細胞［10］。將密度為 2×106個/mL的細胞懸液接種到培養瓶中，放入37℃、5%CO2培養箱中培養2～3 h。輕搖培養瓶，傾棄瓶中液體。再用Hanks液清洗2次，除去未貼壁的細胞。加入培養液，鏡鑒。瓶中已貼壁的細胞主要是巨噬細胞，純度可達95%。少量混雜的細胞為淋巴細胞和中性粒細胞，繼續培養24 h，換液，除去已變性死亡的中性粒細胞，得到接近純凈的巨噬細胞。

1.2.4 巨噬細胞的接種和培養［10］

將純化巨噬細胞的培養瓶快速冷凍至2℃，待細胞收縮后猛搖或吹打培養瓶，使細胞從瓶壁上脫落下來。制成細胞懸液，計數并調節細胞密度。以2×105～4×105個/cm2的密度接種細胞。加入適量培養液RPMI1640(20%的胎牛血清)在37℃、5%CO2的飽和水蒸汽培養箱中靜息培養2 h后用于試驗。

1.2.5 細胞成活率的檢測

采用MTT法檢測細胞成活率［11］，取24孔細胞培養板，每孔中加入密度為2×105～4×105個/cm2的細胞，加入不同質量濃度的WPS－1的培養液，使WPS －1 的最終質量濃度分別為 1、3、10、30、100 μg/mL，每孔最終體積為500 μL。設空白對照孔(不加任何藥物，只有細胞和培養液)。每一質量濃度6個重復孔。置于37℃、5%CO2的飽和水蒸汽培養箱中培養預訂時間。棄去培養液上清液，用PBS洗滌細胞兩次，每孔加 500 μL 0.5 mg/mL MTT 染液，在37℃、5%CO2的飽和水蒸汽培養箱中繼續培養4～6 h。每孔加入 500 μL 含10%SDS(用 10 mmol/L 鹽酸配制)的溶液，在37℃、5%CO2的飽和水蒸汽培養箱中繼續培養過夜，讓結晶物完全溶解，測定570 nm處的OD值。

1.2.6 WPS－1對小鼠腹腔巨噬細胞中細胞因子mRNA表達水平的影響

取6孔細胞培養板，每孔中加入密度為2×105～4×105個/cm2的細胞。根據前期考察WPS－1質量濃度對脾淋巴細胞相關細胞因子mRNA表達的影響，WPS－1質量濃度為40 μg/mL時，各細胞因子mRNA表達接近完全，再增加樣品質量濃度，mRNA表達量基本保持不變。因此本文將WPS－1質量濃度固定為40 μg/mL，每孔最終體積為 500 μL，同時以5 μg/mL的LPSConA作為陽性對照。設空白對照孔(不加任何藥物，只有細胞和培養液)。每一質量濃度6個重復孔。置于37℃、5%CO2的飽和水蒸汽培養箱中培養預訂時間。吸去上清培養液，每孔加入1 mL Trizol試劑，按照Invitrogen公司Trizol試劑說明書提取細胞總的RNA，進行RT－PCR擴增反應，具體操作略。

試驗所用細胞因子引物參照文獻［12－14］，具體如下:

1.2.7 WPS－1對小鼠腹腔巨噬細胞iNOS的mRNA表達水平的影響檢測

應用RT－PCR檢測的mRNA表達水平，方法同1.2.6。

IL－6引物的擴增條件為:95℃保溫2 min，然后3步循環:95℃變性20 s，58℃退火30 s，72℃延伸30 s，共進行36個循環，最后72℃延伸7 min，樣品在4℃中結束反應;TNF－α、iNOS引物的擴增條件為:95℃保溫2 min，然后3步循環:95℃變性20 s，61 ℃退火30 s，72 ℃ 延伸 30 s，共進行 36個循環，最后72℃延伸7 min，樣品在4℃中結束反應。

1.2.8 數據處理

使用SAS 8.01軟件進行數據分析，數據以X±SD表示，以t檢驗法進行組間顯著性差異分析。

2 結果與分析

2.1 WPS－1對小鼠腹腔巨噬細胞成活率的影響

圖1為不同質量濃度WPS－1對小鼠腹腔巨噬細胞的增殖，同空白對照組比，WPS－1為1 μg/mL時，對巨噬細胞增殖無顯著影響(P ＞0.05)，5 μg/mL時有顯著影響(P ＜0.05)，10～160 μg/mL 范圍內有極顯著影響(P＜0.01)。WPS－1促進巨噬細胞增殖，表現出明顯的劑量－效果關系，巨噬細胞的活性隨著WPS－1質量濃度的增加而增加，但到達40 μg/mL后，巨噬細胞的增殖活性趨于穩定。這說明WPS－1作為免疫調節劑的最佳劑量為40 μg/mL。作為陽性對照的LPS和ConA，在5 μg/mL劑量下極顯著地促進巨噬細胞的增殖(P＜0.01)，且比WPS－1最高質量濃度組(160 μg/mL)對小鼠總脾淋巴細胞的增殖促進作用大。這說明WPS－1刺激小鼠總脾淋巴細胞發生有絲分裂的能力低于LPS和ConA這兩種常用的致有絲分裂原。

圖1 WPS－1對小鼠腹腔巨噬細胞增殖的影響

2.2 WPS－1對小鼠腹腔巨噬細胞各細胞因子mRNA表達水平的影響

由圖2可得，與空白對照相比，WPS－1與巨噬細胞培養時間為3、6、12 h時，IL－6 mRNA表達量沒有顯著增加(P＞0.05)，24 h時mRNA表達量有極顯著增加(P＜0.01)，且此時mRNA增加量達到最大，但到48 h時mRNA表達量又下降到初始水平，未有顯著增加(P＞0.05)。可以得出，WPS－1對腹腔巨噬細胞IL－6 mRNA的表達未表現出時效關系，僅在12～24 h時間范圍mRNA表達量突然增加。

圖2 WPS－1對小鼠腹腔巨噬細胞IL－6 mRNA表達的影響

由圖3可知，與空白對照相比，WPS－1與巨噬細胞培養時間為3、6 h時，TNF－α mRNA表達量沒有顯著增加(P＞0.05)，培養12 h時mRNA表達量有顯著增加(P＜0.05)，24 h時mRNA表達量有極顯著增加(P＜0.01)，且此時增加量達到極大值，培養時間延長到48 h時，mRNA表達量迅速減少，但仍表現為極顯著增加(P＜0.01)。可以得出，WPS－1可促進腹腔巨噬細胞TNF－α mRNA的表達，有一定的時效關系，給藥24 h時表達量最高。

圖3 WPS－1對小鼠腹腔巨噬細胞TNF－α mRNA表達的影響

2.3 WPS－1對小鼠腹腔巨噬細胞iNOS的mRNA表達水平的影響

由圖4可見，與空白對照相比，WPS－1與巨噬細胞培養時間為3、6、12 h時，iNOS mRNA表達量都沒有顯著增加(P＞0.05)，僅培養24 h時mRNA表達量表現出極顯著增加(P＜0.01)，且此時增加量達到極大值，培養時間延長到48 h時，mRNA表達量又回到初始水平，沒有顯著增加(P＞0.05)。可以得出，WPS－1可促進腹腔巨噬細胞iNOS mRNA的沒有表現出時效關系，但給藥24 h時表達量達到最大值。

圖4 WPS－1對小鼠腹腔巨噬細胞iNOS mRNA表達的影響

3 討論與結論

3.1 WPS－1可促進小鼠腹腔巨噬細胞的增殖，最佳劑量為 40 μg/mL。

3.2 本文研究的兩種細胞因子TNF－α和IL－6能直接參與巨噬細胞介導的殺傷腫瘤細胞的作用。TNF－α的抗腫瘤作用機理包括TNF－α的直接作用和誘導的針對腫瘤的免疫應答。用40 μg/mL的WPS－1和巨噬細胞共同培養48 h，在不同的時間點檢測IL－6和TNF－α的mRNA表達水平。試驗結果顯示，在共同培養12 h時，巨噬細胞的TNF－α的mRNA表達水平開始有所增加，因為TNF－α有自分泌效應，即分泌的TNF－α可以誘導巨噬細胞分泌TNF－α，所以當時間延長到24 h，TNF－α的表達進一步明顯增加，但是在48 h后，TNF－α的mRNA表達水平下降。IL－6 mRNA表達水平的增加時間出現較晚，應該不是WPS－1直接的對 IL－6的增加作用，可能是 TNF－α對其產生影響，因為TNF－α能促進巨噬細胞分泌IL－6。但是同時產生的IL－6反過來又會抑制巨噬細胞產生TNF－α。檢測WPS－1處理的巨噬細胞內iNOS的mRNA表達水平，發現在共同培養24 h后，iNOS的mRNA表達才增加，由此可見iNOS的mRNA的增加并非WPS－1的直接誘導作用。促使iNOS的mRNA表達增加可能的原因是，由于WPS－1可以誘導巨噬細胞產生TNF－α，巨噬細胞產生的TNF－α又反過來促進巨噬細胞iNOS基因的表達，從而產生NO。

3.3 WPS－1可提高小鼠巨噬細胞的活性，從而增加IL－6和TNF－α這兩種細胞因子以及iNOS的分泌量。

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Immunomodulating Effects of Rapeseed Polysaccharide WPS－1 on Mouse Peritoneal Macrophage

Zhu Jianfei1，2Tang Chunhong1，2Wu Moucheng3
(College of Environmental and Biological Engineering，Chongqing Technology and Business University1，Chongqing 400067)
(Natural and Health Food Research Institute，Chongqing Technology and Business University2，Chongqing 400067)
(College of Food Science and Technology，Huazhong Agricultural University3，Wuhan 430070)

The MTT assay was adopted to measure cell activation.Rapeseed polysaccharide WPS －1 promoted proliferation macrophage cells in a dose－ dependent manner.The optimal concentration of WPS －1 to promote proliferation was 40 μg/mL.Semi－ quantitative RT － PCR was performed to determine changes in cytokine mRNA expression.The influence of WPS－1 to IL －6，tumor necrosis factor－ α (TNF － α)，and inducible nitric oxide synthase(iNOS)mRNA expression were all 40 μg/mL.The best time of WPS －1 to promote IL －6，TNF － α，iNOS mRNA of expression were all 24 h.The results indicated that rapeseed polysaccharide could enhance the immune regulation of peritoneal macrophages.

rapeseed polysaccharide，macrophage，immunomodulating effects

TS229

A

1003－0174(2011)08－0041－05

“十五”國家重大科技專項(200lBA501 A20)，“十一五”湖北省重大科技攻關項目(2006AA 20lB32)

2010－10－25

朱建飛，男，1979年出生，講師，博士，食品科學與工程