不同改性方法對蛋白質溶解性的影響研究進展

任為聰 程建軍 張智宇 趙偉華 朱秀清

(東北農業大學食品學院1，哈爾濱 150030)

(國家大豆工程技術研究中心2，哈爾濱 150030)

不同改性方法對蛋白質溶解性的影響研究進展

任為聰1程建軍1張智宇1趙偉華1朱秀清2

(東北農業大學食品學院1，哈爾濱 150030)

(國家大豆工程技術研究中心2，哈爾濱 150030)

溶解性是蛋白質主要的功能特性之一，更重要的是，溶解性是蛋白質生理功能特性及其他加工功能特性的前提和基礎。通過對蛋白質溶解性的物理、生物酶及化學改性3大類改性方法進行了分類論述，分析了不同改性方法對蛋白質溶解性的影響。其中，物理方法介紹了微波、超聲波及熱處理等方法;生物酶方法介紹了木瓜、堿性及胰蛋白酶等處理方法;化學方法介紹了不同活性基團的改性方法。分別對各種改性過程中蛋白質的結構變化和蛋白質溶解性提高的機理進行了初步探討。通過物理、生物酶和化學等方法等來引起分子結構的微變化，可使人們獲得各種符合預期的性能優良的蛋白產品。

改性 蛋白質 溶解性

蛋白質產品由于良好的功能特性和較高的營養特性已經被廣泛的應用于食品行業，用來改善食品的質地和營養等。依據來源，蛋白質產品可分為植物性蛋白質產品和動物性蛋白質產品。由于不同來源蛋白質的氨基酸組成的差異，造成了蛋白質功能性的差異［1］，其中溶解性是蛋白質的一個重要的功能特性。蛋白質的自身結構和溶液中的pH值、離子強度以及溫度等都是蛋白質溶解性重要的影響因素［2］。蛋白質的溶解性可表達為氮溶解指數(NSI)和蛋白質分散指數(PDI)2種。

大量的研究發現蛋白質的功能性與溶解性有著密切的聯系，通過蛋白質的溶解性來體現其他的功能性［1，3］。隨著蛋白質溶解性的提高，蛋白質的凝膠性、乳化性和發泡性都得到了相應的提高［4－8］，因此提高蛋白質的溶解性具有重要的意義。隨著蛋白質改性技術的不斷發展和研究手段的不斷更新，蛋白質改性的機理的研究不斷深入，研究表明蛋白質結構的變化直接影響蛋白質的溶解性?，F在，通常采用物理方法、生物酶方法和化學方法改變蛋白質高級結構、肽鏈長度和側鏈基團，從而提高蛋白質溶解性。本文將對這3大類蛋白質溶解性的改性方法進行比較和總結。

1 物理改性蛋白質溶解性

物理改性就是利用機械剪切力、熱(輻射)、聲、電場、高壓和超聲等物理方式對蛋白質的空間結構進行修飾，促使蛋白質空間結構發生改變，造成蛋白質中親水性氨基酸殘基向蛋白質外部遷移，從而使蛋白質水和能力加強，溶解度提高。

1.1 超聲波改性

超聲波的瞬態空化作用使能量密度高度聚集，故能在崩潰瞬間作用產生高壓、高溫等一系列極端物理效應［9］，從而使蛋白質分子發生了結構的變化，溶解性提高。利用超聲波處理可較好的提高蛋白質的溶解性。

研究證實，超聲處理有效地提高了蛋白質的溶解度，Wanlop Chanasattru等［10］認為經超聲波處理過的球狀蛋白質，蛋白質分子性質和在溶劑化能力發生了改變，使得蛋白質體積縮小，在溶劑中的可壓縮性增強，從而使蛋白質更易分散在溶劑中。同樣Jambrak等［4－5］利用20 kHz的超聲波探頭處理乳清蛋白和大豆蛋白后，認為蛋白質溶解性明顯提高的原因是由于超聲波的空化作用使得蛋白質結構展開，肽健斷裂，蛋白質分子質量減小，更多的親水性氨基酸處在外層;但Chuan－He Tang等［11］持相反的意見，其研究表明經超聲波處理過的大豆分離蛋白，在溶解中形成了可溶性聚合物，這個聚合物主要依靠分子間疏水作用，氫鍵和二硫鍵來維持其穩定的。

超聲處理從根本上改變了蛋白質原有的結構特性，因此提高了蛋白質溶解性。研究學者對超聲處理過程中蛋白質的結構變化存在不同的觀點，一種認為是蛋白質分子質量的減小，蛋白質親水性氨基酸殘基增多，溶劑化能力提高造成的;另一種認為是蛋白質聚合，將疏水性氨基酸殘基掩蔽在聚合物中心，使外層親水性氨基酸殘基數量相對增高，溶解性提高。造成這兩種截然相反的結果可能和處理樣品的濃度、溫度、pH值及超聲波設備頻率的不同所造成的。

1.2 熱改性

正常情況下，絕大多數的人考慮到，高溫會使蛋白變性，也就是說蛋白質經熱處理后，肽鏈舒展結構發生變化，大量疏水性基團暴露在蛋白質表面，蛋白質發生熱變性，蛋白質溶解性急劇下降［1］。但是，很多研究卻得到了不同的結果:Estela L Arrese、S Petruccelli和 Jorge R Wagner等［12－14］研究者對高溫處理后的大豆分離蛋白溶解性進行了研究，發現100℃處理后的大豆分離蛋白仍然具有較高的溶解性。

我們通過熱處理高溫變性豆粕，蛋白質的溶解度也得到顯著的提高。通過研究發現高溫條件下大豆分離蛋白的高溶解性是由于7S和11S之間的亞基通過二硫鍵重新結合，疏水作用力使得疏水性基團向新聚合物中間聚集，形成可溶性聚合物，因此加熱在一定條件下可以提高蛋白質的溶解性。

1.3 微波改性

Choi等［15］利用微波技術對大豆進行處理，結果發現大豆細胞微結構明顯被破壞，能明顯的提高可溶性大豆蛋白的含量。經過微波處理過的鱈魚可溶性蛋白質，經SDS－PAGE分析發現分子質量明顯降低，較大分子質量的亞基消失，出現兩條20 ku的新條帶，證明鱈魚蛋白質通過微波處理后發生了降解作用［16］，使得鱈魚可溶性蛋白質含量提高。微波造成水分子激烈的原地震動，使得水分子與蛋白質分子相互碰撞次數增加，這種震動和撞擊造成了大量的能量聚集，當達到一定程度后便會向外釋放大量熱［17］。由于微波的輻照和產生的大量熱從而導致蛋白質空間結構發生變化，蛋白質分子質量減小，親水性氨基酸殘基大量暴露，溶劑化能力增強，蛋白質溶解性提高。

1.4 靜態超高壓改性

食品的高壓處理技術，一般是指將密封于柔性容器內的食品置于以水或其他液體作為傳壓介質的壓力系統中，采用高靜水壓處理食品，以達到殺菌、抑酶和改善食品的功能特性等作用。靜態超高壓能使蛋白質分子相互聚合成為聚合物，分子質量增大，有利于與水相互作用，在水中形成100～200 nm的微粒。試驗證明，壓力從0～600 MPa，蛋白質溶解性先下降后上升［18］。Wang XianSheng 等［6］發現經過靜態超高壓處理過的不同品種大豆分離蛋白，隨著壓力的增大，溶解性呈現非線性的變化，并且達到最大溶解度時所需的壓力不同。通過對表面疏水性和表面巰基的測定發現，蛋白質高級結構在處理過程中不斷變化，蛋白質疏水作用力和共價鍵(二硫鍵)共同決定著可溶性蛋白質的高級結構。

伴隨著壓力的變化，蛋白質發生聚合，形成分子質量更大的聚合物，這些聚合物將阻礙蛋白質溶解的疏水性氨基酸殘基掩蔽在聚合物中心，這些疏水性氨基酸殘基相互作用形成了蛋白質非共價鍵維持聚合物的穩定性。由于非共價鍵的鍵能較低較不穩定，因此，當聚合物初步形成時，中心部分半胱氨酸殘基相互作用形成更為穩定的共價鍵(二硫鍵)。

1.5 超高壓均質改性

均質處理過程中，劇烈的處理條件，如高壓、剪切力、空穴爆炸力和溫度會導致蛋白質特性的變化。對經過超高壓均質改性處理過的蛋白質溶解性提高的機理，學術界持兩種觀點，一種是Sang－Ho Lee等［19］研究發現經過超高壓均質處理的乳清蛋白，蛋白質二級結構的α－螺旋和β－折疊均減少，高級結構舒展，大量疏水基團暴露并相互之間吸引，形成可溶性聚合物。而另一種是涂宗財等［20］認為經過超高壓均質處理的花生蛋白質的肽鏈被打開，溶解度上升。這是由于凝聚的球狀的大豆分離蛋白經處理后逐漸解締和伸展，蛋白質分子解聚成一些更小顆粒亞基單位(7S的三聚體解聚變成單鏈，11S的亞基分離)而且亞基單位進一步有一定程度的伸展，使得球狀蛋白質內部的極性基團和疏水基團暴露出來，蛋白質分子(顆粒)的表面電荷分布加強，圍繞著新暴露的極性基團的結合水增多，蛋白質的水化作用增強，溶解性也得到了改善［21］。

1.6 脈沖電場改性

Li Yingqiu等［22］利用脈沖電場對大豆分離蛋白處理后，發現調整適當的脈沖強度和時間，大豆分離蛋白產生極性并且亞基分解、高級結構開始伸展，分子構象變化，導致表面巰基和表面疏水基團被埋藏于分子內部，增強了蛋白質與水的相互作用，使得蛋白質溶解性提高。

不同的物理改性方法都不同程度的提高了蛋白質的溶解性，其主要通過極端的物理效應改變蛋白質二、三和四級結構，或形成以不同化學鍵連接的可溶性聚合物，使蛋白質親水基團外露，蛋白質溶劑化能力提高，溶解性及其他相關功能性得以提高。但具體的反應機理尚無統一定論，有些仍存在相反的理論假設，因此需要科研人員不斷的探索，去找到真正的答案。通過物理改性的蛋白質無毒副作用，可大規模生產，但耗能較多。

2 酶法改性蛋白質溶解性

蛋白的酶法改性是指通過蛋白酶部分降解蛋白質，或增加其分子內或分子間交聯或連接特殊功能基團，改變蛋白質的功能性質。酶按來源可分為動物性蛋白酶(胰蛋白酶、胃蛋白酶和糜蛋白酶等)、植物性蛋白酶(菠蘿蛋白酶、木瓜蛋白酶和無花果蛋白酶等)和微生物蛋白酶(Alcalase堿性蛋白酶、中性蛋白酶和復合蛋白酶等)。

2.1 植物性蛋白酶改性

植物蛋白酶一般為半胱氨酸蛋白酶，主要裂解化學鍵在Lys/Arg/Phe的羧基(木瓜蛋白酶)、Phe/Tyr的羧基(無花果蛋白酶)和Lys/Arg/Phe/Tyr的羧基(菠蘿蛋白酶)［1］。Kazunobu Tsumura 等［7］利用木瓜蛋白酶控制性水解大豆分離蛋白的β－半球蛋白，結果發現β－半球蛋白水解液凍干粉在pH 7.0和pH 8.0時的溶解性和凝膠型均高于大豆分離蛋白，并且黏度較低。B P Lamsal等［8］利用菠蘿蛋白酶對大豆粉、大豆分離蛋白、擠壓大豆粉和大豆濃縮蛋白進行了2%和4%的限制性酶解，由于酶解使得可電離氨基酸和羧基基團的大量暴露使得限制性水解后的蛋白溶解性明顯高于未水解對照樣。

2.2 微生物性蛋白酶改性

微生物酶大部分為絲氨酸蛋白酶，主要裂解化學鍵在疏水性氨基酸的羧基;只有中性蛋白酶為金屬蛋白酶，其作用在 Leu/Phe的氨基［1］。Jin－Yeol Lee等［23］利用0.05 ～0.2 mol/L 的弱酸對脫脂豆粉進行預處理，再利用Alcalase堿性蛋白酶和復合蛋白酶分別進行酶處理。結果這種復合處理使蛋白質溶解性達到95%以上，并且蛋白溶液的黏度相對較低。Stein Ivar Aspmo 等［24］利用 Alcalase1 2.4 L，Neutrase1 0.8 L，ProtamexTM，木瓜蛋白酶，菠蘿蛋白酶，混合植物蛋白酶等6種不同來源的蛋白酶對大西洋鱈魚蛋白進行了改性處理。經處理后的蛋白質的氮溶解指數均在80%以上，并且α－氨基酸含量上升后趨于平緩。Walsh等［25］對大豆分離蛋白先用Alcalase限制性水解，再用谷氨酞胺轉移酶交聯化處理，其溶解度在pH 3.0～5.0條件下明顯提高;其中在水解度為2%時經交聯化后，在低pH下大豆分離蛋白溶解度最大。經這種方法處理大豆蛋白在低酸性食品和飲料中有很大用途。

2.3 動物性蛋白酶改性

動物性蛋白酶分為絲氨酸蛋白酶和天冬氨酸蛋白酶兩類，主要作用化學鍵為Lys/Arg的羧基(胰蛋白酶)，芳香族羧基和氨基、Leu/Asp/Glu的羧基(胃蛋白酶)［1］。Sook Y Kim 等［26］利用胰蛋白酶控制性水解大豆蛋白，結果發現明顯提高了大豆蛋白的乳化性和溶解性。Guan Xiao等［27］和 Yin ShouWei等［28］利用胰蛋白酶分別水解米糠蛋白和麻蛋白，分別控制水解度在4.1% ～8.3%和2.3% ～6.7%，得到與Sook Y Kim等［26］相類似的結果，麻蛋白的溶解性、乳化性、乳化穩定性、保水性和持油性均得到了不同程度的提高。Iskender Arcan等［29］利用胃蛋白酶對鷹嘴豆蛋白在37℃下水解24 h，結果發現可溶性蛋白質是原來的1.2～2倍，自由基清除能力是原來的1.9～3倍，并且在油水乳化體系中抗氧化能力和金屬螯合能力均得到增強。

酶法改性是通過修飾或切斷蛋白質氨基酸側鏈和肽鏈，去除蛋白質疏水性基團，破壞蛋白質高級結構，使蛋白質的分子質量減小，更多的親水性氨基酸殘基與水接觸，完成提高蛋白質溶解性的過程。不同來源的酶由于其作用位點的差異，造成了酶改性后蛋白質側鏈基團和肽鏈長短的的不同，但對于提高蛋白質溶解性的作用機理相類似。酶法改性安全可靠，但深度水解后的蛋白質其他功能特性往往因為高級結構的破壞而下降。

3 化學改性蛋白質溶解性

利用化學方法引入化學基團，交聯在蛋白質肽鏈上，從而改變蛋白質的功能特性。通過引入帶負電荷的基團來改變蛋白的等電點，使它在中性或微酸性介質中仍具有良好溶解性。引入一些含有硫醇基、雙硫基等基團，能提高植物蛋白的黏彈性、凝膠性。經亞硫酸鈉、亞硫酸氫鈉和半胱氨酸處理后，使蛋白質分子間和分子內的二硫鍵斷裂、亞基伸展、疏水基暴露，使大豆蛋白分散性和溶解性提高。

表1 蛋白質的一般化學改性方法［30－31］

3.1 磷酸化改性

蛋白磷酸化就是有選擇地利用蛋白質側鏈活性基團，分別結合一個磷酸根基團，從而大量引進磷酸根基團，通過改變蛋白質的電負性，提高了蛋白質分子之間的靜電斥力，使之在食品體系中相互排斥，更易于分散，因而能夠提高蛋白質的溶解性和聚結穩定性，并改變了等電點［1，30］。化學磷酸化效率高、功能特性改善明顯、磷酸化試劑價格低廉、易于實現工業化等優點深受重視。S K Nayak等［31］在水牛乳蛋白中(酪蛋白、沉淀物和乳清蛋白)添加POCl3進行了磷酸化處理。結果發現乳清蛋白在水溶液，Na鹽溶液和Ca鹽溶液中的溶解性均明顯提高。親水性磷酸基團被交聯在蛋白質側鏈，使得蛋白質的親水性增強，溶解性提高。

Ross和 Campbell等［32－33］用酶法對大豆蛋白進行了磷酸化處理并對功能特性進行了深入研究，結果表明，酶磷酸化的大豆蛋白的溶解性有明顯的改善并且反應能在較溫和的條件下進行。

酶法磷酸化較化學磷酸化反應條件更溫和，安全性更高，但反應效率及反應速率較慢。

3.2 酰基化改性

?；饔镁褪堑鞍踪|分子的親核基團(如氨基或經基)與親電基團(如撥基)相反應，從而在大豆蛋白分子結構中引入親水基團［1］。利用琥珀酸酐和棕櫚酸N－羥琥珀酰亞胺酯做為酰化劑，使琥珀?；妥貦磅；c大豆分離蛋白(SPI)共價結合。結果表明琥珀酰化改性大豆蛋白分子中的氨基被琥珀?；〈?，分子的凈負電荷增加，表面非極性基團減少，分子柔性增強，因而水溶性增加，表面疏水性下降。棕櫚?；男赃^程中，疏水性棕櫚?；囊朐黾恿说鞍踪|的疏水性;同時高濃度的脲使大豆球蛋白分子展開，內部疏水基團暴露，疏水相互作用增強，蛋白質趨于聚合和沉淀，溶解度下降［34］。

3.3 磺酸化改性

蛋白質在高熱和高剪切力條件下發生熱變性，形成結構復雜并且穩定的蛋白質產物，主要由非共價鍵(氫鍵、疏水作用力和范德華力等)和共價鍵(二硫鍵)連接。對膨化后的產物進行化學處理，加入尿素破壞非共價鍵，加入DTT(或β－巰基乙醇)破壞共價鍵(—S—S—)，從而進行磺酸化，使原本呈高度疏水性的蛋白質結構變為松散的長肽鏈，親水性氨基酸殘基充分與水相互作用，使得蛋白質溶解性升高［35－37］。

3.4 表面活性劑改性

Anupam Malhotra等［38］將表面活性劑用來改性大豆分離蛋白質，結果發現陰離子表面活性劑SDS對溶解性影響最大，使得分離蛋白在等電點附近仍具有較高的溶解性。這是由于SDS改變蛋白質的表面性質，發生結團現象，親水性基團外露，使得蛋白質更具親水性。

化學改性通過引入親水性化學基團或斷裂化學鍵對蛋白質進行修飾，完成掩蔽和包埋蛋白質疏水性氨基酸殘基的目的，或直接引入親水性極強的基團，使蛋白質表面親水性提高，來達到提高蛋白質溶解性的目的。化學改性方便、快捷，并且改性效果十分顯著，但改性后蛋白質的安全性問題一直被人們所關注。

4 展望

蛋白質具有良好的營養價值和加工特性，尤其加工特性和功能特性依賴蛋白質良好的溶解性，因此通過改性技術提高蛋白質溶解性是成為改善蛋白質功能性的主要手段。

3類蛋白質改性技術對蛋白質溶解性的提高都有一定的作用，但是還有許多地方需要深入的研究與探討。由于改性中反應機理的尚無統一，因此改性過程中提高蛋白質溶解性的機理研究將成為研究工作者下一步的研究熱點。物理改性的能耗問題，化學改性中的毒理問題以及生物酶改性中蛋白質其他功能性下降問題，都將是急需解決的關鍵技術。此外，復合改性技術在提高蛋白質溶解性，改善其他功能特性的研究將是主要的目標。

總之，隨著科學技術手段的不斷進步，蛋白質溶解性改性的方法將也不斷被更新，使得蛋白質加工技術得到良好的發展，將有更多更好的蛋白質走入人們的生活中。

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Study on Different Modification Methods on Solubility Properties of Protein

Ren Weicong1Cheng Jianjun1Zhang Zhiyu1Zhao Weihua1Zhu Xiuqing2
(College of Food Science，Northeast Agricultural University1，Harbin 150030)
(National Soybean Engineering and Technique Research Center2，Harbin 150030)

Solubility is one of major functional features of the protein.In particular，it is the precondition and basis for physiologic function and other processing functions of the protein.In this paper，three modification methods，including physical，biologic enzyme and chemical modification，on solubility properties of protein，were summarized，to analyze the effects of different modification method on protein solubility.The solubility modification of protein via physical ways including microwave irradiation，ultrasound，heat treatment and so on are reviewed;for the enzymic ways，the modification using papain，alaclase and trypsin was discussed;for the chemical ways，the different active groups were reviewed.The above modification methods might cause microvariation of protein molecular structure so that the people could obtain various high－quality protein as anticipated.

modification，protein，solubility

TS201.2

A

1003－0174(2011)08－0123－06

黑龍江省科技計劃(GB08B401－02)

2010－08－15

任為聰，男，1985年出生，碩士，農產品加工與儲藏

程建軍，男，1969年出生，副教授，植物蛋白與多糖的綜合利用