一株犬細小病毒的分離及VP2基因序列分析

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一株犬細小病毒的分離及VP2基因序列分析

楊龍峰①李英杰①艾萍萍①肖勝南①韓 柳②焦萬亮①王建芬①張延光①劉月煥③*（①北京市延慶縣農業局 102100 ②北京誠安動物醫院 ③北京市農林科學院畜牧獸醫研究所）

采集病犬的糞便，經處理后接種狗腎傳代細胞系(MDCK)，培養96h無任何細胞病變，盲傳到第3代時細胞系出現明顯的細胞脫落，核圓縮，形成CPE (cytopathic effect)。繼續傳代到第7代。第1、2代的細胞培養物不能凝集豬的紅細胞，第3代以后的細胞培養物可以凝集豬的紅細胞。采用PCR技術，在各代次的培養物中均能擴增得到特異性的DNA片斷，經序列測定后鑒定為犬細小病毒，定名為BJY06。為進一步研究該分離株的遺傳演化情況，擴增得到了VP2基因的全序列。經序列測定，用DANStar軟件分析表明BJY06毒株為CPV-2a亞型，所得到的VP2基因全長1755bp，含有完整的閱讀框架，編碼584個氨基酸。與其它亞型的毒株相比較核苷酸的同源性為98.3%~99.6%。氨基酸同源性為97.1%~100%。

犬細小病毒 病毒分離 鑒定 PCR VP2 序列分析

1978年，犬細小病毒(canine parvovirus,CPV)同時從加拿大(Thomson等)、澳大利亞(Kelly)患腸炎的病犬中分離獲得[1]。CPV可引起犬的出血性腸胃炎和心肌炎，并使白細胞大量減少，在幼犬中的發病率和死亡率都很高，癥狀與貓泛白細胞減少癥相似。本病雖出現的時間不長，但目前已擴散到世界各地，幾乎所有養犬的地方都有本病的存在[2]。1982年10月，我國報道在暴發傳染性出血性腹瀉的病犬的糞便提取物中發現細小病毒，隨后，在我國各地陸續有本病發生的報道。

本試驗從臨床發病犬的糞便中分離到一株犬細小病毒，定名為BJY2006。對其VP2基因進行了擴增測序，初步確定為2a亞型。對該病毒的遺傳特性與演化進行了研究，以期為更好地為預防和控制犬細小病毒病提供資料。同時為大范圍的對CPV進行流行病學調查提供可行的方法。

1 材料和方法

1.1 材料

病料采自于北京市某動物醫院的病犬。狗腎傳代細胞(MDCK)購于中國獸醫藥品監察所。D-MEM營養液、UNIQ-10柱式病毒DNA抽提試劑盒、EZ-10 Spin Column DNA Gel Extration Kit 等購買于上海生物工程有限公司。犬細小病毒快速診斷試紙條購買于軍事醫學科學院實驗動物中心。參考GeneBank中的已發表的CPV的VP2核酸序列，使用primer5.0軟件設計了兩對引物，由上海生物工程有限公司合成。

主要儀器 PCR儀(PTC-200)、CO2培養箱(SANYO)、高速冷凍離心機(SIGMA)。

1.2 方法

1.2.1 病毒分離培養 將病犬糞便用PBS緩沖液10倍稀釋，再加1/5量的氯仿混和均勻，靜置2min后4000rpm，離心10min，取上清，經0.22μm的微孔濾膜過濾，收取濾液-30℃保存。生長成單層的MDCK細胞消化，傳代，37℃培養6h后，觀察細胞貼壁完全，再加入1/20量的病料濾液，37℃繼續培養，每天2次觀察細胞病變。96h進行傳代培養，共傳7代。每代細胞培養96h收獲，反復凍融3次，3000rpm，離心10min，收取上清-30℃保存。

1.2.2 HA試驗和金標試紙條檢測 取病料濾液、各代次的細胞培養物根據文獻介紹的方法做HA試驗[3]。根據金標試紙條使用說明書檢測并記錄結果。

1.2.3 病毒DNA的提取 根據UNIQ-10柱式病毒DNA抽提試劑盒說明書進行操作。

1.2.4 PCR擴增 反應體系為50μL，同時設立陰性、陽性對照。退火溫度為55℃進行PCR反應，1.0%瓊脂糖凝膠電泳，在顯像儀中觀察結果并拍照。

1.2.5 DNA的純化 按照EZ-10 Spin Column DNA Gel Extration Kit 試劑盒的說明書進行，純化的DNA送大連寶生物工程公司進行測序。

2 結果

（1）接種病料的MDCK細胞在傳到第3代時出現明顯的細胞病變，病變發生在接種后50h，表現為細胞圓縮、顆粒增多，胞核濃縮，脫落，拉網，病變逐日嚴重。對照細胞生長正常，表明細胞系中有病毒生長。

（2）糞便濾液、各代次培養物的HA、試驗結果及PCR擴增結果如表1。

表1 不同方法檢測CPV的結果

（3）PCR擴增及序列測定結果：使用引物F2，R2擴增到了小于500bp的DNA片斷(圖1)，與預期的大小相符。經純化后進行序列測定，堿基數為426bp，與GeneBank中的已發表序列比對同源性為100%。表明分離得到了犬細小病毒毒株。使用引物F1、R1擴增到了2000bp左右大小的DNA片段與預期大小相符(圖2)。

圖1 CPV特異性PCR結果

M.DNA Marker DGL2000; 1.BJY06 PCR擴增產物(426bp) 2.CPV疫苗株的PCR擴增產物(426bp)。3.陰性對照。

圖2 CPV VP2基因PCR結果

M. DNA Marker DGL2000; 1.BJY06 PCR擴增產物(1955bp) 2. CPV疫苗株PCR陽對照(1955bp)。3.陰性對照。

表2 犬細小病毒VP2核酸和氨基酸變異位點比較

（4）序列測定結果：用引物F1、R2擴增的產物長度為1955個核苷酸，包含完整的VP2全基因，由1755個核苷酸組成，編碼584個氨基酸。發生有意義突變的核苷酸及相應的氨基酸(表2)進行比較分析，BJY06分離株為CPV-2a亞型。

3 討論

從本試驗結果可以看出，同HA、金標試紙條檢測方法相比較，PCR方法能檢出更少量的CPV，即PCR方法更敏感，特異性更強。HA方法并不能準確檢出CPV，HA陽性只能非特異地表明有病毒生長，靈敏度也不高，而且觀察結果也帶有較大主觀性；金標試紙條方法特異性比HA方法好，但靈敏度也不高，只有在病毒含量達到一定濃度時，有效反應才能發生。相比較認為PCR方法可作為MDCK細胞中病毒繁殖的一種特異、敏感的檢測方法。

本試驗把PCR檢測技術與病毒分離培養技術相結合，成功的對犬細小病毒進行了分離。PCR檢測方法的高敏感性可以檢測到在MDCK中生長的微量病毒，能夠在MDCK細胞未發生明顯病變前檢測出CPV的存在，從而提高CPV分離的成功率。同時隨著寵物疾病診斷條件的提高，PCR診斷方法在臨床工作中的應用也將逐漸成為現實。

2005年邱薇等[4]對我國不同地區分離到的9株細小病毒毒株進行了VP2基因的擴增和序列分析，并與CPV的參考毒株進行了比較，依據圖3所示的氨基酸的變化規律，進行了亞型鑒定，9株CPV中有6株屬CPV-2a，3株屬CPV-2b，未檢測到CPV-2c變異株，表明我國目前仍以CPV-2a流行為主。本次試驗分離到的毒株經序列比對也是CPV-2a亞型。該分型方法與使用單克隆抗體進行犬細小病毒亞型鑒定相比具有經濟、方便的特點，國內外的研究者已逐漸認可并使用該分型方法。為今后進行大范圍的CPV的流行病學調查提供了依據。

BJY06毒株的VP2基因序列進行遺傳演化分析(圖3)表明，BJY06與另2個中國分離株B-2004和CH-GN同在一個分支內，但親緣關系最近的是日本株FPV-31、臺灣株T37和中國株B-2004。中國2005年毒株CPV-GN雖然與BJY06仍有較近的進化關系，但為CPV-2b亞型。BJY06與其它亞型的毒株相比較核苷酸的同源性為98.3%~99.6%。與FPV~377的氨基酸同源性最低，為97.1%，與V129、V120、T4、T37、Taiwan 9的同源性最高，為100%。

圖3 .VP2基因遺傳進化樹DC, domestic cat; DD, domestic dog; MK, mink; BF, blue fox. JPN, Japan; TWN, Tai wan; CHN, China; VTN, Vietnam; FNL, Finland.

與其它的CPV-2a亞型毒株相比較，在遺傳進化關系上與日本毒株sho-nan在同一個分支內，與V154的距離最遠。核苷酸同源性在99.3%~99.6%。BJY06與CPV-31的氨基酸同源性最低為99.7%，與V129、V120、T4、T37、Taiwan 9的氨基酸同源性均為100%。表明在該亞型內的氨基酸變異很小，幾乎是沒有變化。在297和555位氨基酸美國株CPV-31為S(絲氨酸)和I(亮氨酸)而BJY06和其它的中國、日本毒株為A(丙氨酸)和V(纈氨酸)。這兩個位點的不同究竟有何意義需要進一步研究。

[1]殷震，劉景華.動物病毒學: 第2版[M].北京：科學出版社，1997：1145-1173.

[2]董江麗，李淑芬，張鶴齡。犬細小病毒中國內蒙株VP2基因克隆及序列分析[J]。中國病毒學，2000,15(4):379-387.

[3]蔡寶樣, 殷震. 動物傳染病診斷學[M]. 南京: 江蘇科學技術出版社, 1993: 418- 422.

[4]邱薇,范泉水,李作生.犬細小病毒VP2基因的比較及分型研究[J].動物醫學進展,2005,26 (5):69-72。

[5]Ikeda Y, Mochizuki M, Naito R,Predominance of canine parvovirus in unvaccinated cat population and emergence of new types of CPVs in cats. Virology, 2000:278:13-19.

S852.65+5

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（2010–10–27）