葵花籽分離蛋白不同酶解產(chǎn)物清除自由基活性的研究

王海鳳 王常青 呂 鵬 劉佳璐 許 潔 趙陳勇

(山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院1，太原 030006)

(山西大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院2，太原 030006)

葵花籽分離蛋白不同酶解產(chǎn)物清除自由基活性的研究

王海鳳1王常青1呂 鵬1劉佳璐2許 潔1趙陳勇1

(山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院1，太原 030006)

(山西大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院2，太原 030006)

分別采用Alcalase酶與酸性蛋白酶、Alcalase酶與胃蛋白酶兩種組合方式酶解葵花籽分離蛋白，依次得到多肽A和多肽B兩組酶解產(chǎn)物。研究表明:這兩組酶解產(chǎn)物對(duì)·OH、O2·－和DPPH·自由基的清除作用均明顯高于葵花籽分離蛋白(P＜0．05);與谷胱甘肽(GSH)相比，多肽A在一定范圍內(nèi)清除·OH和O2·－的效果顯著高于GSH(P＜0．05)，清除DPPH·的效果低于GSH;而多肽B清除O2·－和DPPH·的效果不及GSH。電泳技術(shù)和凝膠層析分析發(fā)現(xiàn)，多肽A、B兩組酶解產(chǎn)物的相對(duì)分子質(zhì)量分布有所不同，盡管這兩種多肽的分子質(zhì)量大部分都小于3 000 u，但是多肽A中小于1 000 u的多肽比例大于多肽B，達(dá)到62．44%。

葵花籽多肽 自由基 分子質(zhì)量分布

人體新陳代謝產(chǎn)生的自由基過(guò)量會(huì)導(dǎo)致心血管疾病、腦神經(jīng)損傷、衰老等諸多疾病。因此，尋找一種高效、低毒的自由基清除劑，用于降低體內(nèi)自由基水平、延緩衰老、防治疾病，已成為目前研究的熱點(diǎn)。隨著對(duì)小分子功能肽的深入研究，人們已成功地從玉米、蛋清和海洋動(dòng)物［1］等動(dòng)植物蛋白資源中酶解得到具有清除自由基作用的活性肽，葵花籽作為一種重要的油料作物，其榨油后剩余的餅粕中也含有豐富的蛋白質(zhì)，但是國(guó)內(nèi)外對(duì)于葵花籽蛋白酶解產(chǎn)物多肽的研究報(bào)道相對(duì)較少。我國(guó)葵花資源豐富，開(kāi)發(fā)葵花籽多肽的成本低，應(yīng)用前景良好。本文研究葵花籽分離蛋白在不同酶解工藝條件下水解得到兩組酶解產(chǎn)物，分析各自的分子質(zhì)量分布范圍，并以谷胱甘肽和葵花籽分離蛋白為對(duì)照，研究了兩組產(chǎn)物對(duì)清除自由基的效果，以及抗氧化活性機(jī)理與分子質(zhì)量的關(guān)系，為將其開(kāi)發(fā)成功能性食品基料提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1．1 試驗(yàn)材料

葵花籽分離蛋白:自制;牛血清蛋白、卵清蛋白、核糖核酸酶A、維生素B12、抑肽酶:美國(guó)sigma公司;Alcalase酶、酸性蛋白酶和胃蛋白酶:天津大茂化學(xué)試劑廠;超低分子質(zhì)量蛋白(Marker 3．4～20．1 ku):上海升正生物技術(shù)有限公司;谷胱甘肽(GSH):上海銳聰科技發(fā)展有限公司;其他試劑均為AR級(jí)。

1．2 主要儀器

JY－C電泳儀:北京君意東方電用設(shè)備有限公司;凝膠色譜系統(tǒng)(HD－003－C紫外檢測(cè)儀和XWT－1044S臺(tái)式記錄儀):上海天成科技有限公司;WFZ UV－2100型紫外分光光度計(jì):尤尼柯上海儀器有限公司。

1．3 試驗(yàn)方法

1．3．1 多肽A和多肽B的酶解工藝

將葵花籽蛋白溶液在92℃預(yù)處理5 min后，分別用不同的兩步酶解工藝，制備兩組酶解產(chǎn)物，記作多肽A和多肽B(見(jiàn)表1)。多肽A制備:先用Alcalase酶水解5 h，滅酶后加入酸性蛋白酶再水解6 h。多肽B制備:同樣先用Alcalase酶水解5 h，滅酶后加入胃蛋白酶再水解6 h。各酶均在各自最佳條件下水解。最終酶解液經(jīng)沸水滅酶，離心取上清液，測(cè)定測(cè)定A、B兩種水解液中總氮含量(TN)、游離氨基氮的含量(AN)、水解度(DH)和多肽得率，初步分析兩種工藝對(duì)葵花籽蛋白的酶解效果。

表1 兩種不同酶解工藝用酶最佳水解條件

1．3．2 指標(biāo)測(cè)定方法

TN的測(cè)定采用半微量凱氏定氮法。AN測(cè)定按照GB/T5009．39的甲醛滴定法。多肽含量測(cè)定采用三氯乙酸沉淀法［2］。

水解度DH=AN/TN×100%

多肽得率=上清液中多肽含量/樣品中的TN×100%

1．3．3 葵花籽多肽A和多肽B分子質(zhì)量測(cè)定

1．3．3．1 Tricine－SDS －PAGE 電泳分析

以標(biāo)準(zhǔn)蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量的對(duì)數(shù)logMr(縱坐標(biāo))和相對(duì)遷移率Rf(橫坐標(biāo))作圖，得到相對(duì)分子質(zhì)量Mr與遷移率Rf標(biāo)準(zhǔn)曲線的的回歸方程logMr=－1．648 9Rf+4．573 1，根據(jù)樣品的相對(duì)遷移率 Rf(蛋白帶遷移距離/溴酚藍(lán)遷移距離)，分析計(jì)算葵籽多肽的分子質(zhì)量分布。

1．3．3．2 SephadexG －75 凝膠層析分析

將5種標(biāo)準(zhǔn)蛋白:牛血清蛋白、卵清蛋白、核糖核酸酶A、抑肽酶和VB12分別上樣至Superdex 75 10/300 GL 凝膠色譜柱，用含 0．15 mol/L NaC1，pH 7．0的PBS緩沖液洗脫，在280 nm檢測(cè)，計(jì)算得到分子質(zhì)量對(duì)數(shù)和出峰體積的回歸方程。在同樣條件下用回歸方程和面積歸一法計(jì)算樣品中不同分子質(zhì)量的分布。

1．3．4 體外抗氧化活性測(cè)定

1．3．4．1 羥自由基(·OH)清除活性的測(cè)定［3］

取0．75 mmol/L的鄰二氮菲溶液1 mL于10 mL具塞試管中，依次加入2 mL 0．2 mmol/L PBS緩沖液(pH 7．4)、1 mL 0．75 mmol/L FeSO4溶液立即混勻，加入1 mL不同濃度的樣品溶液，混勻后加入1 mL 0．01%H2O2，用去離子水定容，37 ℃水浴 60 min，在510 nm處測(cè)定其吸光度值。對(duì)羥自由基的清除率按下式計(jì)算:

清除率 =［(A1－A0)/(A2－A0)］×100%

式中:A1為加入H2O2和樣品時(shí)的吸光度;A0為加入H2O2但不加樣品時(shí)吸光度;A2為H2O2與樣品都不加時(shí)的吸光度。

1．3．4．2超氧陰離子(O－·2)清除活性的測(cè)定［4］

用鄰苯三酚自氧化法。

超氧自由基清除率=［(V0－V1)/V0］×100%

式中:V0為對(duì)照組鄰苯三酚的自氧化速率;V1為樣品組鄰苯三酚的自氧化速率。

1．3．4．3 DPPH 清除活性的測(cè)定［5］

取不同濃度的樣品溶液 2 mL，加入 2 mL 0．1 mmol/L DPPH溶液混勻，避光反應(yīng)30 min后，于517 nm處測(cè)定吸光度值A(chǔ)1;空白組以代替DPPH溶液，對(duì)照組以等體積蒸餾水代替樣品溶液。清除率按下式計(jì)算:(清除率=［1－(A1－A0/A2］×100%

式中:A1為樣品組吸光度，A0為空白組吸光度，A2為對(duì)照組吸光度。

1．3．5 統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)均運(yùn)用SSPS12．0軟件進(jìn)行。

2 結(jié)果與討論

2．1 兩種酶解工藝基本指標(biāo)比較

兩種酶解工藝制備的多肽A和多肽B上清液中總氮含量(TN)、游離氨基氮的含量(AN)、水解度(DH)和多肽得率檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可知，多肽A水解度略低于多肽B，而多肽得率卻高于多肽B，這可能與酸性蛋白酶和胃蛋白酶的酶切效果有關(guān)，酸性蛋白酶酶切位點(diǎn)比較廣泛，所以多肽的得率相對(duì)較高。但這些指標(biāo)尚需進(jìn)一步分析多肽的分子量分布來(lái)驗(yàn)證。

表2 兩種酶解工藝指標(biāo)比較

2．2 兩種酶解物的分子量分布對(duì)比

2．2．1 Tricine－SDS－PAGE 電泳分析

圖1 多肽A、B的電泳圖譜

由電泳圖譜(圖1)可見(jiàn)，多肽樣品A和B對(duì)大分子蛋白和多肽水解效果較好，在10 000 u以上幾乎沒(méi)有條帶出現(xiàn)，并且樣品在分子質(zhì)量3 400 u以后呈現(xiàn)的電泳譜帶著色較深并連續(xù)聚集。說(shuō)明多肽A與B的分子質(zhì)量大多數(shù)處于3 400 u以下。同時(shí)根據(jù)樣品遷移率Rf計(jì)算可知與樣品B相比，樣品A中含有的分子質(zhì)量＜1 500 u的小分子肽較多。

2．2．2 Superdex G －75凝膠層析分析

SuperdexG－75凝膠色譜分析得到相對(duì)分子質(zhì)量Mr與洗脫體積Ve的回歸方程logMr=－0．180 9Ve+6．561 7，計(jì)算得知多肽樣品A和B在6 500 u之前幾乎沒(méi)有出現(xiàn)洗脫峰，第一個(gè)峰對(duì)應(yīng)的分子質(zhì)量都在3 000 u左右，小于3 000 u的多肽都在75%以上(見(jiàn)表3)。但是，多肽A在23 mL以后有多個(gè)的洗脫峰，而多肽B在此之后沒(méi)有洗脫峰出現(xiàn)。計(jì)算發(fā)現(xiàn)，先經(jīng)堿性蛋白酶、再用酸性酶酶解的多肽A中，小于1 000 u的小分子多肽為62．44%;而先經(jīng)堿性蛋白酶、再用胃蛋白酶酶解的多肽B中小于1 000 u的小分子多肽為46．4%?？梢?jiàn)，多肽A中的小分子肽比多肽B多，與電泳分析結(jié)果基本一致。

表3 葵籽多肽A、B分子質(zhì)量分布/%

2．3 葵花籽多肽A、B清除自由基的效果

2．3．1 清除羥自由基(·OH)的活性比較

羥基自由基是生物體內(nèi)最具進(jìn)攻性的活性氧，它可以通過(guò)多種方式與生物體內(nèi)分子作用，由圖2、表4可知，在不同濃度下，多肽A和B以及GSH對(duì)·OH的清除率均顯著強(qiáng)于葵籽分離蛋白(P＜0．05)，清除效果為多肽A＞多肽B＞GSH＞葵籽分離蛋白。在試驗(yàn)濃度下，兩種葵籽多肽的清除效果均顯著優(yōu)于GSH(P＜0．05)。

圖2 多肽A和B的superdexG－75凝膠色譜

表4 葵籽分離蛋白、葵籽多肽和GSH對(duì)羥自由基(·OH)的清除作用(x±s，n=6)

2．3．2 清除超氧陰離子自由基的活性比較

超氧陰離子濃度過(guò)高會(huì)對(duì)蛋白質(zhì)、DNA等大分子造成損傷［7］。由表5可見(jiàn)，葵籽多肽A和B對(duì)O－·2的抑制作用隨濃度的增加抑制作用提高。多肽A在低濃度(1～4 mg/mL)時(shí)其清除率低于GSH(P＜0．05)，但在高濃度(10 mg/mL)與GSH的清除效果處于同一水平，這可能是在較高濃度下，多肽A中具有清除O－·2的活性多肽之間的交互效應(yīng)增強(qiáng)所至。多肽B在不同濃度下對(duì)O－·2的清除率均低于谷胱甘肽(P＜0．05)?？ㄗ逊蛛x蛋白在此體系中不溶解，故不能用來(lái)做對(duì)照組。

表5 多肽A、多肽B和GSH對(duì)清除超氧陰離子()的清除作用(x±s，n=6)

表5 多肽A、多肽B和GSH對(duì)清除超氧陰離子()的清除作用(x±s，n=6)

注:*表示多肽組與GSH組對(duì)照，P＜0．05

質(zhì)量濃度/mg/mL/%多肽A 多肽B清除率GSH 1 73．21 ±0．12* 55．43 ±0．31*98．72 ±0．02 62．42 ±0．21 4 85．29 ±0．12* 72．82 ±0．12* 90．78 ±0．32 10 96．87 ±0．12 84．62 ±0．15*

2．3．3 清除DPPH自由基的活性比較

樣品對(duì)DPPH自由基的清除作用反映了其遞H+能力［8］。試驗(yàn)表明(見(jiàn)圖3)，多肽A和B在不同濃度范圍內(nèi)，對(duì)DPPH·的清除作用，均顯著強(qiáng)于葵籽分離蛋白(P＜0．05)，且隨濃度增加而增強(qiáng)。但從整體趨勢(shì)看，谷胱甘肽＞多肽A＞多肽B＞分離蛋白。清除DPPH·的作用多肽A強(qiáng)于多肽B這一結(jié)果與清除·OH和O－·2)的結(jié)果不同，原因可能與清除·OH和O－·2)的反應(yīng)體系是水溶液，而清除DPPH的反應(yīng)體系為醇溶液體系有關(guān)。

圖3 葵籽蛋白、多肽A、多肽B和GSH對(duì)DPPH的清除作用

3 結(jié)論

用葵花籽分離蛋白為原料，采用Alcalase酶+酸性蛋白酶的水解得到多肽A，采用Alcalase酶+胃蛋白酶的水解得到多肽B。Tricine－SDS－PAGE電泳和Superdex G－75凝膠層析分析結(jié)果都表明多肽A與B的分子質(zhì)量較小，大多數(shù)處于3 400 u以下，但是樣品A中含有的小于1 500 u小分子肽較樣品B多。兩組樣品的清除自由基的試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在任何條件下，葵花籽多肽清除自由基作用均顯著優(yōu)于葵籽分離蛋白，說(shuō)明葵花籽蛋白轉(zhuǎn)化為多肽具有實(shí)際意義。多肽A和多肽B清除·OH的效果顯著高于谷胱甘肽;多肽A在高質(zhì)量濃度(10 mg/mL)時(shí)，清除的效果與GSH的清除率相當(dāng)，但多肽B不如GSH;兩種酶解產(chǎn)物對(duì)DPPH的清除率均不如GSH。總體來(lái)看多肽A比多肽B清除自由基效果好，更適合開(kāi)發(fā)抗氧化產(chǎn)品。

［1］宋春麗．抗氧化肽的研究進(jìn)展［J］．農(nóng)產(chǎn)品加工:學(xué)刊，2008，7:112 －114

［2］魯偉，任國(guó)譜，宋俊梅．蛋白水解液中多肽含量的測(cè)定方法［J］．食品科學(xué)，2005，26(7):169 －171

［3］黎勇坤，李聰，古昆，等．H2O2/Fe2+體系中羥基氧化行為的抑制與促進(jìn)［J］．云南大學(xué)學(xué)報(bào)2002，24(4):302－305

［4］陳留勇，孟憲軍，賈薇，等．黃桃水溶性多糖的抗腫瘤作用及清除自由基、提高免疫活性研究［J］．食品科學(xué)，2004，25(2):167－170

［5］胡雪瓊，周盛華，夏杏洲，等．馬氏珠母貝肉酶解產(chǎn)物清除自由基活性的研究［J］．食品工業(yè)科技，2009，30(5):97－99

［6］方光榮，劉立明，李玲，等．羥基自由基的流動(dòng)注射熒光法測(cè)定［J］．分析科學(xué)學(xué)報(bào)，2004，20(1):63－65

［7］余慶皋，王曉春，鐘飛．不同劑型生脈散對(duì)氧自由基清除作用的比較［J］．吉首大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版，2007，28(3):123－125

［8］Jung M J，Heo S I，Wang M H．Free radical scavenging and total phenolic contents from methanolic extracts of Ulmus davidiana［J］．Food Chemistry，2008，108(2):482 －487．

Study on Free Radicals Scavenging Activity of Different Hydrolysates from Sunflower Seed Protein

Wang Haifeng1Wang Changqing1Lv Peng1Liu Jialu2Xu Jie1Zhao Chenyong1

(College of Life Science and Technology，Shanxi University1，Taiyuan 030006)
(Department of Chemistry，Shanxi University2，Taiyuan 030006)

Sunflower seed proteins were prepared with two different bienzymatic hydrolysis processes respectively with two compositions of Alcalase and acid protease＆ Alcalase and pepsin，and then two groups of hydrolysates respectively noted the peptides A and B were obtained in turn．The research showed that the free radical scavenging activities on·OH、and DPPH· of peptide A and B were significantly higher than sunflower seed proteins(P＜0．05);compared with glutathione(GSH)，the scavenging effects of peptides A on·OH andwere significantly higher than GSH(P ＜0．05)，but the effects of DPPH scavenging were lower than GSH;while the effects on scavengingand DPPH of peptides B were lower than GSH．The results of electrophoresis and gel chromatography analysis showed that molecular weight distribution of peptides A and B were different，their molecular weight were less than 3 000 u，but the peptide A with low molecule weight less than 1 000 u accounted for the higher proportion than peptide B，of which the proportion reached 62．44%in peptide A．

sunflower seed peptides，free radical，molecule weight distribution

TS201．1

A

1003－0174(2011)03－0056－04

2010－04－19

王海鳳，女，1985年出生，碩士，食品科學(xué)

王常青，男，1956年出生，教授，碩士生導(dǎo)師，營(yíng)養(yǎng)與功能食品的開(kāi)發(fā)