纖維素酶法水解大豆異黃酮糖苷研究

錢麗麗 左 鋒 張永忠

(黑龍江八一農墾大學食品學院1，大慶 163319)(東北農業大學理學院 國家教育部大豆生物學重點實驗室2，哈爾濱 150030)

纖維素酶法水解大豆異黃酮糖苷研究

錢麗麗1左 鋒1張永忠2

(黑龍江八一農墾大學食品學院1，大慶 163319)(東北農業大學理學院 國家教育部大豆生物學重點實驗室2，哈爾濱 150030)

為了提高大豆異黃酮的生物活性作用，獲得更多的大豆異黃酮苷元成分，對纖維素酶水解大豆異黃酮進行了研究，通過單因素試驗和正交試驗，酶水解的影響因素主要為水解溫度、水解時間、酶－底物質量比和酶水解pH值。得到纖維素酶制備大豆異黃酮苷元的較優工藝條件:纖維素酶水解時間17 h，水解溫度48．5℃，水解pH值5．0，酶－底物質量比為1．05%。通過小試試驗，以脫脂豆粕原料進行提取大豆異黃酮，纖維素酶水解得到苷元產品收率為0．1%，總苷元質量分數為30．79%;以30%大豆異黃酮粉為原料進行水解，獲得產品收率為10．2%，總苷元質量分數為47．81%。

纖維素酶 染料木黃酮 黃豆苷元

近年來，流行病理學與動物臨床醫學研究表明大豆異黃酮苷元(主要是染料木黃酮和黃豆苷元［1］)具有弱雌激素活性、抗氧化活性、抗溶血活性和抗真菌活性，能有效地預防和抑制白血病、骨質疏松、胃癌、乳腺癌和前列腺癌等多種疾病的發生，尤其是對乳腺癌和前列腺癌有積極的預防和治療作用［2］。對大豆異黃酮進一步深入研究還表明，大豆異黃酮對清除體內自由基［3］、延緩機體衰老、預防和治療由紫外線照射引起的皮膚老化和各種皮膚癌也具有很好的療效［4］。大豆中的大豆異黃酮主要以糖苷形式存在，大豆異黃酮苷元含量甚少，僅占總異黃酮質量的2%～3%，目前近5年國內工藝研究主要集中在獲得更多苷元形式的大豆異黃酮的加工技術上，由糖苷型到苷元型大豆異黃酮的轉化方式有酸水解法、堿水解法、Smith降解和酶法，最為可行的是酶法水解制備大豆異黃酮苷元，研究較多用β－葡萄糖苷酶水解大豆異黃酮糖苷鍵。孫艷梅等［5］自制了大豆β－葡萄糖苷酶經純化后水解大豆異黃酮糖苷效果較好。許晶［6］采用里氏木霉β－葡萄糖苷酶在反應溫度50℃、水解時間90 min、pH 4．5、加酶量20 U 的條件下水解染料木黃酮水解率為99%。對其他酶的研究還未見報道。試驗采用工業化用酶纖維素酶對水解大豆異黃酮的條件進行探索，根據纖維素酶水解糖苷鍵的原理，通過單因素試驗和正交試驗酶法水解獲得最佳水解工藝。

1 材料與方法

1．1 材料與儀器設備

黃豆苷(Daidzin簡寫D)、黃豆苷元(Daidzein簡寫為De)、染料木苷(Genistin簡寫為G)、染料木黃酮(Genistein簡寫為Ge):Sigma公司。纖維素酶:諾奧科技發展有限公司(經測定酶活力38 000 U/mg)。豆粕(東農32):東北農業大學贈送。30%大豆異黃酮粉:哈高科。試驗所用甲醇為色譜級，其余試劑為分析純。

CX－500型超聲波清洗機:北京醫療設備二廠;LG10－2．4A型高速離心機:北京醫用離心機廠;H．H．S 21－2R型電熱恒溫水浴鍋:上海醫療器械五廠;ZFQ85A型旋轉蒸發器:上海醫械專機廠;P680戴安高效液相色譜儀:美國戴安公司。

1．2 方法

1．2．1 大豆異黃酮含量測定

高效液相分析條件:

流動相:甲醇∶0．5%乙酸 =40∶60，色譜柱:Nova－Pak C18(3．9 ×150 mm)，柱溫:50℃，流速:1．0 mL/min，檢測波長:254 nm，進樣量:10 μL。

根據標準品染料木黃酮、黃豆苷元、染料木苷和黃豆苷各自性質不同，經紫外檢測器測定，樣品與標準品比較，以保留時間定性、峰面積定量、外標法計算。

纖維素酶水解制得大豆異黃酮苷元得率的測定:

大豆異黃酮苷元得率=水解前后大豆異黃酮苷元含量差/水解后大豆異黃酮總含量×100%

1．2．2 大豆異黃酮提取液的制備

試驗采用脫脂豆粕作為原料，稱量脫脂豆粕(過40目篩)1．0 g，80%乙醇浸提劑10 mL，60 ℃水浴振蕩3 h，調等電點 pH 4．5，3 000 r/min 離心10 min，上清液為大豆異黃酮提取液。

1．2．3 纖維素酶水解糖苷型大豆異黃酮為苷元型大豆異黃酮的工藝路線

用纖維素酶在適合條件下進行大豆異黃酮酶水解的研究，以酶水解后大豆異黃酮苷元含量增加為指標判定酶的選擇依據，纖維素酶水解工藝如下:

大豆異黃酮提取液→旋轉蒸發儀蒸去乙醇→加入醋酸鹽緩沖液→纖維素酶解→酶滅活→冷卻→乙酸乙酯萃取→旋轉蒸發儀蒸去乙酸乙酯→丙酮溶解→離心→上清液→蒸去丙酮→乙醇溶解定容→膜過濾→HPLC測定大豆異黃酮各組分含量。

以下試驗均進行3次重復，結果以平均值進行計算。

1．2．4 纖維素酶單因素試驗

1．2．4．1 時間對酶水解得率的影響

取1．0 g脫脂豆粕加入15 mL 80%乙醇60℃下水浴振蕩提取3 h，2次提取，離心后合并濾液，旋轉蒸發除去乙醇，醋酸－醋酸鈉溶液調pH至5．0的緩沖液100 mL，加酶－底物質量比為1．0%，同時做空白樣(即不加酶只加底物看豆粕自身水解情況)，在50 ℃下分別水浴振蕩水解4、8、12、16、20 h 經 HPLC檢測以苷元水解得率為指標，確定最佳水解時間。

1．2．4．2 溫度對酶水解得率的影響

取1．0 g脫脂豆粕加入15 mL 80%乙醇60℃下水浴振蕩提取3 h，2次提取，離心后合并濾液，旋轉蒸發除去乙醇，醋酸－醋酸鈉溶液調pH至5．0緩沖液100 mL，加酶－底物質量比為1．0%。分別在45、50、55、60℃下水浴振蕩水解8 h。經HPLC檢測以苷元水解得率為指標，確定最佳水解溫度。

1．2．4．3 pH 對酶水解得率的影響

取1．0 g脫脂豆粕加入15 mL 80%乙醇60℃下水浴振蕩提取3 h，2次提取，離心后合并濾液，旋轉蒸發除去乙醇，分別用醋酸－醋酸鈉溶液調pH至4．0、4．5、5．0 和 5．5 緩沖液各 100 mL，加酶 － 底物質量比為1．0%，在50℃下水浴振蕩水解8 h。經HPLC檢測以苷元水解得率為指標，確定最佳水解pH。

1．2．4．4 不同酶－底物質量比對酶水解得率的影響

取1．0 g脫脂豆粕加入15 mL 80%乙醇60℃下水浴振蕩提取3 h，2次提取，離心后合并濾液，旋轉蒸發除去乙醇，醋酸－醋酸鈉溶液調pH至5．0緩沖液100 mL，分別加酶－底物質量比為0．6%、0．8%、1．0%、1．2%、1．4%，同時做空白樣(即不加酶只加底物看豆粕自身水解情況)，分別在50℃下水浴振蕩水解8 h。經HPLC檢測以苷元水解得率為指標，確定最佳酶－底物質量比。

1．2．5 纖維素酶正交試驗確定酶水解條件

表1 正交試驗因素水平表

2 結果與分析

2．1 纖維素酶單因素試驗

2．1．1 不同酶－底物質量比對大豆異黃酮苷元水解得率的影響

由圖1可知，隨著添加纖維素酶－底物質量比不斷增加，苷元水解得率也不斷迅速增加，當增加到1．0%時大豆異黃酮苷元水解得率較高。

圖1 纖維素酶酶－底物質量比對大豆異黃酮苷元水解得率的影響

2．1．2 時間對大豆異黃酮苷元水解得率的影響

由圖2可知，纖維素酶水解時間隨著時間的延長，苷元水解得率增加，達到一定時間以后，水解得率上升緩慢，纖維素酶水解時間為16 h時有較優水解得率。

圖2 纖維素酶水解時間對大豆異黃酮苷元水解得率的影響

2．1．3 pH對大豆異黃酮苷元水解得率的影響

由圖3可以看出，pH對酶活力影響較大，不同的pH環境內，大豆異黃酮苷元水解程度有很大差異，當pH為4．0時，大豆異黃酮苷元水解得率只有20%，而當pH為5．0時大豆異黃酮苷元水解得率增加一倍，其總水解苷元得率可達到近45%。

圖3 pH對大豆異黃酮苷元水解得率的影響

2．1．4 溫度對大豆異黃酮苷元水解得率的影響

由圖4可以看出，溫度對纖維素酶水解得率影響較前面幾個因素較小，當溫度在50℃時有較高苷元水解得率。

圖4 溫度對大豆異黃酮苷元水解得率的影響

2．2 纖維素酶正交試驗

由表2可以看出影響纖維素酶水解效率的主次因素依次為B＞A＞D＞C。表明溫度和水解時間是影響糖苷型大豆異黃酮水解的主要因素，而酶－底物質量比和pH是次要因素。最佳水解條件為A3B1C2D3，即纖維素酶水解時間17 h，水解溫度48．5℃，水解pH 5．0，酶 －底物質量比為1．05%。

表2 正交試驗方案及結果

2．3 纖維素酶水解制備富含苷元大豆異黃酮粉

利用上述較優條件進行富含苷元的大豆異黃酮粉，采用豆粕和30%含量的大豆異黃酮粉為原料，進行纖維素酶水解，多次萃取，回收溶劑干燥后得到富含苷元的大豆異黃酮。經HPLC檢測苷元含量及收率見下表3。水解前后樣品色譜圖見圖5、圖6。

表3 纖維素酶法制備大豆異黃酮苷元

由表3可計算出5 g含量30%的大豆異黃酮經纖維素酶水解后可得到黃豆苷元177 mg，染料木黃酮67 mg;10 g脫脂豆粕經纖維素酶水解可得到黃豆苷元 1．07 mg，染料木黃酮 3．9mg。

由圖5、圖6可見，由峰出現的先后順序檢測物質依次為:溶劑峰、黃豆苷D(5 min)、染料木苷G(8 min)、丙二酰基黃豆苷MD(15 min)、丙二酰基染料木苷MG(25 min)、黃豆苷元De(23 min)、染料木黃酮Ge(40 min)，水解后黃豆苷元De和染料木黃酮Ge峰明顯增加，黃豆苷和染料木苷峰明顯減小，說明纖維素酶水解糖苷鍵效果明顯。

3 結論

試驗是通過尋找工業化酶制備富含苷元的大豆異黃酮中，初步確認纖維素酶能夠水解制備大豆異黃酮苷元，通過單因素試驗和正交試驗得出采用纖維素酶水解糖苷形式大豆異黃酮為苷元形式大豆異黃酮較優條件為:水解時間17 h，水解溫度48．5℃，水解pH 5．0，酶－底物質量比為1．05%。通過以脫脂豆粕原料進行提取大豆異黃酮，纖維素酶水解得到苷元產品收率為 0．1%，總苷元質量分數為30．79%;30%大豆異黃酮粉獲得產品收率為10．2%，總苷元質量分數為47．81%。

［1］張永忠，孫艷梅．大豆異黃酮研究中的名詞術語［J］．中國糧油學報，2004，(4):46 －49

［2］Kritz Silverstein D，Goodman Gruen D L．Usual dietary isoflavone intake，bone mineral density，and bone metabolism in Postmenopausal Women［J］．Womens Health Gend．Based Med．2002，11(1):69 －78

［3］Ghosh P，Fenner G P．Improved method for gas chromatographic analysis of genistein and daidzein from soybean(glycine max)seeds［J］．Agric．Food Chem，1999，47(9):3455 －3456

［4］Wang G，Kuan S．A simplified HPLC method for the determination of phytoestrogens in soybean and its processed products［J］．Agric．Food Chem．，1990，38:185 －190

［5］孫艷梅，張永忠．大豆β－葡萄糖苷酶水解大豆異黃酮糖苷的研究［J］．中國糧油學報，2006，21(2):86－89

［6］許晶，孫艷梅．里氏木霉β－葡萄糖苷酶水解大豆異黃酮糖苷的工藝研究［J］．中國糧油學報，2009，24(3):31 －34．

Hydrolysis of Soybean Isoflavone Glucosides by Cellulase

Qian Lili1Zuo Feng1Zhang Yongzhong2

(College of Food Science，August－ first Land Reclaim University1，Daqing 163319)
(College of Science，ScienceNortheast AgricultureUniversity，Key Laboratory of Soybean Biology of National Ministry of Education2，Harbin 150030)

For increasing the biological activity of soybean isoflavones and producing aglycon from soybean isoflavones，soybean isoflavones hydrolysis by cellulase was studied．The single factor experiment and orthogonal experiment revealed that the affecting factors during the enzymatic hydrolysis of soybean isoflavones were hydrolysis temperature，time，enzyme dosage and pH，and the following best conditions of the enzymatic hydrolysis were obtained:enzymatic hydrolysis time 17 h，temperature 48．5 ℃，pH 5．0，and enzyme dosage 1．05%．Taking isoflavones extracted from defatted soybean meal as raw material to be hydrolyzed by cellulase，the yield of aglycon was 0．1%，the total aglycon content of product was 30．79%．Taking 30%isoflavones meal as material，the aglycon yield was 10．2%，and product aglycon content was 47．81%．

cellulase，genistein，aglycon

TS218

A

1003－0174(2011)03－0016－04

黑龍江省“十一五”重大科技攻關專項大豆綜合加工關鍵技術研究與開發(GA06B402－4)

2010－02－26

錢麗麗，女，1979年出生，講師，天然保健功能因子開發

張永忠，男，1953年出生，教授，研究生導師，食品化學