弓形蟲Prugniaud株感染小鼠后腦組織病理學動態觀察*

吳升偉,包懷恩,葛 爽,李小燕

2.貴州省疾病預防控制中心,貴陽 550004

弓形蟲病是由剛地弓形蟲(Toxoplasma gondii)感染引起的嚴重危害健康的一種人獸共患性疾病,其病原體弓形蟲是重要的專性細胞內寄生的機會性致病原蟲,可以感染包括人在內的所有哺乳動物、鳥類和爬行動物,并在人和多種動物的有核細胞內發育和繁殖,從而引起宿主細胞和組織的炎癥和壞死等非特異性病變。對人群中弓形蟲感染的流行病學調查資料顯示,全世界大約有25%～50%的人受到感染,我國的感染率為5%～10%[1]。弓形蟲具有親神經性的特點,腦組織是弓形蟲最易侵犯的部位之一。有報道稱90%以上的全身性弓形蟲病患者死于弓形蟲腦部感染及其誘發的弓形蟲腦炎[2]。除此之外,近年發現弓形蟲感染是艾滋病患者最常見的機會性感染之一,有10%～30%艾滋病患者可并發弓形蟲腦炎,并且是其死亡的主要原因之一[3]。

弓形蟲Prugniaud株是人體和動物感染的優勢蟲株之一[4],其毒力弱于RH強毒株,該蟲有速殖子和緩殖子兩種狀態,前者有較強侵襲性,后者容易在宿主腦組織中形成包囊。為觀察這株弓形蟲在宿主弓形蟲性腦病中的病理變化及機制,本實驗以腹腔感染途徑向ICR小鼠注入弓形蟲Prugniaud株包囊,建立小鼠感染模型,應用常規組織病理學方法、免疫組織化學法及PCR檢測弓形蟲特異性基因的方法,觀察小鼠腦組織病理變化與蟲體的關系及弓形蟲包囊在腦的形成和存在時間,以為弓形蟲腦病組織病理學診斷提供依據,并為進一步研究腦組織中包囊活化的發生機理奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 6～8周齡SPF級ICR雌性小鼠,體重20～25g,購自北京維通利華實驗動物技術有限公司(小鼠許可證編號SCXK(京)2006-0009)。

1.2 蟲株 弓形蟲Prugniaud株由蚌埠醫學院孫新教授和南京醫科大學陳錫慰教授惠贈,本室在昆明小鼠體內傳代保種。

1.3 主要試劑 兔抗弓形蟲多克隆抗體購自美國ViroStat公司,兔抗體免疫組化試劑盒購自深圳欣博盛生物科技有限公司,DNA提取試劑盒及DNA marker購自寶生物工程(大連)有限公司,瓊脂糖購自Electrop Grade西班牙公司,2×PCR Green mix購自北京鼎國生物技術有限公司。

1.4 引物的合成 根據GenBank上弓形蟲RH株(序列號：AF179871.1)B1基因序列,利用DNAMAN軟件進行引物設計,上游引物：5′-GGAACTGCATCCGTTCATGAG-3′,下游引物 ：5′-TCT TTAAAGCGT TCGTGGTC-3′,擴增長度194bp,引物由上海生物工程有限公司合成。

1.5 實驗動物感染 將感染Prugniaud株弓形蟲的小鼠用頸椎脫臼法處死,無菌狀態下取小鼠腦組織,放入加有 PBS的勻漿器內制備成腦組織勻漿液,取10μ L勻漿液平鋪在玻片上,于顯微鏡下計數包囊,并于試管內用無菌PBS調整至10個/0.5mL包囊,準備作感染動物用。購買的健康ICR小鼠(雌性,20～25g)經本實驗室適應性飼養后,予感染組小鼠腹腔注射腦組織勻漿液0.5mL/只鼠,對照組小鼠腹腔注射同等量的PBS,其中感染組小鼠接種40只,對照組小鼠22只,分別分籠飼養,每籠5～6只,正常取食及飲水。

1.6 感染小鼠發病情況及指標觀察 感染后每天觀察小鼠,記錄發病情況。于腹腔接種后第 5d、10d、15d、20d、25d、30d、60d、90d、120d、150d 及180d用頸椎脫臼法隨機處死3只感染組小鼠和2只對照組小鼠,取部分小鼠腦組織于10%中性甲醛溶液固定24h,按常規方法進行脫水、石蠟包埋,制作4μ mol/L切片,分別作HE染色和免疫組織化學檢測;同時取部分組織用勻漿器研磨后DNA提取試劑盒抽提組織DNA,具體操作方法見說明書。

1.7 免疫組化檢測 石蠟切片用二甲苯常規脫蠟及入水。染色前用PBS浸泡石蠟切片10 min,然后入3%H2O2-甲醇液中浸泡10 min,PBS洗后加一滴封閉液于組織切片上孵育10min,吸干液體后加適量兔抗弓形蟲多克隆抗體(1∶200)濕盒內孵育30～60min,PBS洗后加一滴生物素化抗兔IgG孵育10min,PBS洗后加一滴鏈親和素標記HRP孵育10min,PBS洗后DAB室溫顯色2～5min后自來水充分沖洗,蘇木素復染,鹽酸酒精分化后氨水泛藍,最后乙醇脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片、鏡檢。陰性對照是用正常PBS代替弓形蟲多克隆抗體,其余步驟同上。結果判定：陽性反應為在抗原定位處見到棕黃或棕褐色沉淀。

1.8 對不同感染時間小鼠腦組織用PCR擴增弓形蟲B1基因特異性片段檢測 反應體系為25μ L,其中 2×PCR Green mix 12.5μ L,無菌雙蒸水 9.5μ L,上下游引物(10μ mol/L)各 1μ L,模板 1μ L,上述反應混合物先在94℃5 min預變性,然后進入循環,94℃30 s,58℃45 s,72℃1min,30個循環,72℃延伸7 min,4℃保存。PCR產物的鑒定：取10μ L擴增產物于2%瓊脂糖凝膠電泳(含0.5 mmol/L溴乙錠)上,100 V,30 min,紫外檢測儀器下觀察,200 bp附近出現條帶判定陽性。

2 結 果

2.1 感染小鼠發病情況及癥狀 感染弓形蟲包囊后第6d小鼠開始出現食欲減退、聳毛、怠惰、抖動、體重減輕、腹脹、腹瀉及死亡等,同時15%小鼠出現死亡,剖檢死亡小鼠發現腹水和肝脾明顯腫大,腹水檢測發現弓形蟲速殖子(圖1)。從第20d開始,小鼠逐漸進入恢復期,飲食、飲水開始恢復,活動開始增加,至第30d,小鼠表現為活動增加、皮毛光滑、食欲好轉,體重開始增加。對照組小鼠無異常。

圖1 箭頭所示為弓形蟲感染小鼠腹水中速殖子,周圍可見假包囊,右下角為標尺,代表 10μ m(Gimesa染色,×1 000)Fig.1 The arrow shows Toxopalsa gondii tachyzoite from peritoneal fluid smear of infected mice,surrounding pseudocyst can be seen,and lowright was scale,which was 10μ m(Gimesa staining,×1 000)

2.2 小鼠的腦組織病理學動態觀察 在上述時間對腦組織進行病理切片,作HE染色,鏡檢結果如下：感染5d時腦組織未見明顯病變。感染10d時腦組織見明顯的神經元變性,神經元周圍出現多個少突膠質細胞圍繞即衛星現象,可見小膠質細胞吞噬死亡的神經元即噬神經現象,未見典型的弓形蟲速殖子。感染15d時偶見小膠質細胞和星形膠質細胞增生形成的膠質結節,并見一個較小的弓形蟲包囊。感染20d時神經膠質結節、衛星現象、噬神經現象及弓形蟲包囊更加多見,珠網膜下腔炎癥細胞明顯增多,以淋巴細胞為主,同時見少量單核細胞。感染25d時見小血管擴張充血,中等量的炎癥細胞圍血管浸潤形成血管套,即袖套現象(圖2-A);神經膠質細胞彌漫性增生形成的結節明顯增多,腦實質及血管周邊可見多個弓形蟲包囊,包囊周圍可見噬神經現象、神經膠質細胞彌漫性增多等改變(圖2-B和2-C);同時可見腦軟化灶(圖2-D),其內見腦組織基質消失,崩解的核碎片及增多的淋巴細胞;珠網膜下腔內血管擴張充血,以淋巴細胞和單核細胞為主的炎癥細胞彌漫性增多(圖2-E)。感染30d時病變與感染25d時的相似。感染60d時腦組織包囊和袖套現象依然明顯,弓形蟲包囊較感染30d時直徑明顯增加,囊內見大量緩殖子,珠網膜下腔見明顯炎癥細胞。感染90d時珠網膜下腔見散在炎癥細胞、纖維母細胞及成垂直樣排列的新生毛細血管,似肉芽組織(圖2-F)。120d后袖套現象開始不明顯,但仍可見明顯的弓形蟲包囊、神經元變性及膠質細胞增生形成結節,珠網膜下腔炎癥反應較前明顯減輕。感染150d和180d時病理變化與120d時類似,珠網膜下腔仍可見少量炎癥細胞浸潤。對照組小鼠腦組織病理切片HE染色未見任何病理學變化。

圖2 弓形蟲感染小鼠腦組織病理學改變A：箭頭所示為弓形蟲感染第25d袖套現象(HE染色,×200)B：黑色箭頭所示為弓形蟲感染第25d弓形蟲包囊,紅色箭頭為神經膠質細胞聚集(HE染色,×400);C：黑色箭頭所示為弓形蟲感染第25d弓形蟲包囊,紅色箭頭顯示噬神經現象(HE染色,×400);D：箭頭所示為感染第25d腦軟化灶(HE染色,×200);E：弓形蟲感染第25d珠網膜下腔見炎癥細胞浸潤及血管擴張充血(HE染色,×200);F：弓形蟲感染90d珠網膜下腔肉芽組織(HE染色,×200)Fig.2 Histopathological changes of the brain in mice infected with Toxoplasma gondiiA ：Arrow show sleeve cuffing at 25d post-infection(HE staining,×200);B：Black arrow show Toxoplasma cyst,and red arrow show neuroglial cell aggregation at 25d post-infection(HE staining,×400);C ：Black arrow show Toxoplasma cyst,and red arrow show neruonophagia at 25d post-infection(HE staining,×400);D：Arrow show cerebral malacia change at 25d post-infection(HE staining,×200);E：Inflammatory cell infiltration,hemangiectasia and hyperaemia on cavitas subarachnoidealis at 25d post-infection(HE staining,×200);F：Granulation tissue on cavitas subarachnoidealis at 90d post-infection(HE staining,×200)

圖3 弓形蟲感染小鼠腦組織免疫組織化學檢測(IHC,×400)A：弓形蟲多克隆抗體在感染第10d腦組織中的表達;B：弓形蟲感染第60d腦組織出現弓形蟲包囊,可見緩殖子(箭頭所示為包囊)Fig.3 Immunohistochemistry test of the brain in mice infected by Toxoplasma gondii(IHC,×400)A：Expression of Toxoplasmagondii polyclonal antibody on the brain at 10d post-infection;B：Toxoplasma cysts including bradyzoite on the brain at 60d post-infection(the arrow shows a cyst)

2.3 免疫組織化學檢測 對腦組織石蠟切片常規進行脫蠟、入水及染色,以腦組織弓形蟲抗原定位處出現棕褐色沉淀判為陽性。通過顯微鏡觀察發現感染第5d時腦組織切片未見棕褐色沉淀,感染第10d時腦組織細胞胞漿和胞核出現棕褐色顆粒狀物質(圖3-A),說明腦組織中存在弓形蟲蟲體或弓形蟲抗原。從感染15d起腦組織中棕褐色物質漸減少并出現染成淡黃色的弓形蟲包囊(圖3-B),可清楚看見囊內緩殖子,直至實驗結束均能看見弓形蟲包囊。對照組小鼠腦組織未見任何陽性反應。

2.4 不同感染時間小鼠腦組織中弓形蟲B1基因特異性片段PCR擴增結果 從腦組織勻漿液中提取組織DNA,用PCR儀進行特異性片段擴增。瓊脂糖凝膠電泳顯示在感染第5d時腦組織DNA中未發現目的條帶,而從感染第10d至第180d,在約200bp大小處見一明顯條帶,考慮為弓形蟲B1基因特異性片段(圖4),說明在這些組織中存在弓形蟲蟲體,而對照組小鼠腦組織未擴增出弓形蟲B1基因特異性片段。

3 討 論

以往的研究證明弓形蟲速殖子可以侵入腦神經元細胞、星形膠質細胞和小膠質細胞等,并在其內成囊,但對于弓形蟲感染所致的腦組織病理損害未見詳盡描述。本次研究發現自Prugniaud株弓形蟲感染第10d開始小鼠腦組織內即出現神經元變性、衛星現象及噬神經現象等病理改變,第15d起出現神經膠質細胞聚集,第20d起珠網膜下腔發現炎癥細胞浸潤,25d起出現炎癥細胞圍血管浸潤即袖套現象,第90d時在珠網膜下腔見肉芽組織,可見弓形蟲Prugniaud株入侵腦組織可直接損傷神經細胞,甚至可造成細胞的變性壞死,并隨時間延長引起小鼠非特異性腦膜腦炎的病理改變,隨之逐漸開始了炎癥修復過程。在感染第10d時,腦組織免疫組化檢測發現了弓形蟲抗原,同時用PCR方法檢測到弓形蟲B1基因特異性DNA,進一步證明了在感染10d時弓形蟲速殖子已經進入腦組織,而這與病變的發生有時間上的相關性;常規組織病理學和免疫組化檢測均從感染第15d標本中發現弓形蟲包囊,且包囊直徑隨感染時間的增加漸增大,內含緩殖子也漸增多,直至感染第180d仍能找到弓形蟲包囊,這些動態變化提示了腦組織的病理損傷主要與弓形蟲速殖子有關,之后表現為病變逐漸修復,而弓形蟲包囊卻長期存在腦組織。然而,在感染第10d時HE染色片上我們未見明顯的弓形蟲包囊或速殖子,這可能是由于包囊尚未形成,而速殖子較小且經過固定脫水,難以辨別出組織切片中蟲體,尤其在核內感染時,不易和核內染色質區別。

圖4 不同感染時間小鼠腦組織中PCR擴增弓形蟲B1基因片段電泳圖M：marker,1：感染第 5d腦組織,2：感染第 10d腦組織,3：感染第 15d腦組織,4：感染第20d腦組織,5：感染第25d腦組織,6：感染第 30d腦組織,7：感染第 60d腦組織,8：感染第90d腦組織,9：感染第120d腦組織,10：感染第150d腦組織,11：感染第180d腦組織Fig.4 B1 gene identification for brain tissue by PCR in different timeM ：100bp lander,1：brain tissue 5d post-infection,2：brain tissue 10d post-infection,3：brain tissue15d post-infection,4：brain tissue 20d post-infection,5：brain tissue25d post-infection,6：brain tissue 30d post-infection,7：brain tissue 60d post-infection,8：brain tissue 90d post-infection,9：brain tissue 120d post-infection,10：brain tissue 150d post-infection,11：brain tissue 180d post-infection

本實驗觀察到的包囊形成與學者Ferguson[5]應用電鏡觀察到的結果基本相似,即第11d出現早期包囊,3～6個月包囊直徑增大,直至22個月均可見包囊,實驗中15d才看見包囊可能是由于檢測手段及取材時間不同導致;組織病理學變化與杜重波[6]等觀察到的自然弱毒株引起小白鼠腦組織病理改變是不完全相同的,后者在感染第7d即可發現袖套現象,且未見明顯的神經細胞軟化壞死的表現,而本實驗在感染第25d時才觀察到袖套現象,并見明顯的腦軟化灶,這些差別的可能原因是所用小鼠品系、級別及蟲株不同引起。實驗中發現感染小鼠第6d開始出現食欲減退、聳毛、腹瀉等癥狀,同時出現15%的死亡,第20d起開始恢復,第30d時如同正常小鼠,這些臨床癥狀的出現與弓形蟲速殖子侵入內臟器官引起這些器官嚴重的病理改變有明顯關系(內臟的病理改變見另文描述)。

免疫組化染色時發現包囊著色較速殖子淺,這與劉俊燕等[7]的觀察結果是一致的,可能原因是由于所用的兔抗弓形蟲多克隆抗體是針對 RH速殖子的,而Prugniaud株和RH株產生的抗原是有一定區別的;同時包囊囊壁較厚且蟲體排列緊密致使弓形蟲抗原不易暴露所致。腦內包囊的長期存在對于免疫力受抑制的患者如艾滋病患者、器官移植和癌癥放化療患者可能造成嚴重危害,是弓形蟲病復發的根源。

[1]于恩庶.中國弓形蟲病[M].香港：亞洲醫藥出版社,2000：18-19.

[2]劉利,董國軍,高振平,等.弓形蟲RH株在實驗小鼠腦組織內的動態分布[J].中國病原生物學雜志,2009,4(9)：670-671.

[3]張永舉,李宏軍,趙旋.艾滋病相關性弓形蟲腦炎的影像學診斷[J].中國艾滋病性病,2008,14(4)：368-370.

[4]王家傳,蔣作君,沈繼龍,等.一個具有診斷價值的弓形蟲基因的發現[J].臨床輸血與檢驗,2005,7(3)：184-186.

[5]Ferguson DJP,Hutchison WM.An ultrastructural study of the early evelopment and tissue cyst formation ofToxoplasma gondiiin the brains of mice[J].Parasitol Res,1987,,73(6)：483-491.

[6]杜重波,郭志剛,馬軍武,等.弓形蟲GJS株、QHO株人工感染小白鼠動態病理學研究[J].中國獸醫科技,1989,12：12-15.

[7]劉俊燕,楊秀珍,吳增強,等.間接免疫酶染色檢測小鼠組織內弓形蟲及抗原[J].天津醫科大學學報,2005,11(3)：356-358.