萬米跑后外周血淋巴細胞凋亡及氧化應激的動態變化

許國喜

(燕山大學體育學院，河北秦皇島 066004)

萬米跑后外周血淋巴細胞凋亡及氧化應激的動態變化

許國喜

(燕山大學體育學院，河北秦皇島 066004)

目的:觀察萬米跑后不同時相人體外周血淋巴細胞凋亡及血液中超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽(GSH)和丙二醛(MDA)活性的變化，探討大強度耐力運動后血液淋巴細胞凋亡的機制。方法:選取8名參加運動會萬米長跑的體育專業男運動員，分別在運動前1天(RG)、運動后2h、24h和48h采血抗凝，分離淋巴細胞，用流式細胞儀檢測血液淋巴細胞凋亡率，并測定血清中SOD活性、GSH和MDA含量。結果:運動后2h和24h外周血淋巴細胞凋亡率顯著高于安靜水平，2h顯著高于24h;48h基本恢復安靜水平。2h血漿中SOD酶活性、GSH和MDA含量均較安靜水平顯著升高;24h SOD和MDA仍顯著高于安靜水平，而GSH水平則無顯著差異;48h后SOD、GSH和MDA均較安靜水平無顯著差異。外周血MDA含量與淋巴細胞凋亡率呈正相關(r:0．757;P:0.001)。結論:萬米長跑對外周血淋巴細胞凋亡率有誘發效應，而凋亡率隨時間的變化呈現“開窗理論”特征。運動引起的機體自由基代謝失衡可能是淋巴細胞凋亡率變化的原因之一。

淋巴細胞凋亡;氧化應激;外周血;萬米跑

細胞凋亡是多細胞生物維持其完整性和自身穩定而在凋亡相關基因調控下發生的細胞程序性死亡方式，是機體維持其生理平衡的重要手段［1］。對免疫系統來說，機體淋巴細胞的凋亡率常常被作為判斷機體免疫能力的一項重要指標［2］。研究認為，大強度急性運動時，由于應激激素的急劇增高，血液動力學發生急劇變化，導致淋巴細胞等免疫細胞快速動員入血，而在大強度運動后，淋巴細胞濃度降低，增值分化及活性降低，免疫球蛋白含量及功能也受到影響，出現免疫低下期，這一免疫低下期被 Pedersen稱為“open windows”期［3］。動物實驗表明，不良的外界刺激可以造成機體淋巴細胞凋亡率的改變，從而影響機體的免疫功能［4］。已有的研究認為大強度耐力運動和急性運動均可引起機體氧化應激，從而使自由基代謝失衡，危害機體。有學者通過動物實驗發現過量運動可誘發淋巴細胞凋亡，降低機體免疫能力，加速衰老［5］。但人體大強度耐力運動后外周血淋巴細胞凋亡的時相性特征研究較少。本文采用流式細胞技術檢測體育專業學生萬米長跑運動后不同時相外周血淋巴細胞的凋亡情況，探討大強度耐力運動后機體免疫能力低下的可能機制;同時通過測定通用的反映氧化應激水平的指標(SOD含量、GSH活性和MDA含量)，并對MDA的含量與淋巴細胞凋亡率進行了相關性檢測，探討人體外周血淋巴細胞凋亡率在運動后發生變化的可能機制。

1 研究對象與方法

1.1 研究對象

燕山大學參加運動會萬米長跑的體育專業運動員8名，均為健康男性。

1.2 研究方法

1.2.1 血樣采集 運動前1天、運動后2h、24h和48h分別采集受試者外周靜脈血1ml，用500μL枸櫞酸鈉抗凝劑抗凝，取抗凝血1ml用于檢測淋巴細胞凋亡，其余抗凝血立即冰凍離心機離心，為測定抗氧化酶與脂質過氧化水平備用。

1.2.2 血液淋巴細胞的提取和淋巴細胞凋亡率的檢測 取抗凝血1ml，與Hank’s液1∶1混勻后，小心加入到2ml的細胞分離液之液面上，以2 000rpm(半徑15cm水平轉子) 15min，收集第二層細胞，放入含Hank’s液4ml的試管中，充分混勻后，以1 700rpm離心10min。吸去上清液，沉淀反復洗兩次得到淋巴細胞。

收集5×105細胞，加入500μl的Binding Buffer懸浮細胞;加入5μl的Annexinⅴ－FITC混勻后，加入5μl Propidium Iodide，混勻;室溫、避光反應15min;在1h內過300目尼龍網上流式細胞儀檢測。用標準品校準光路，保證儀器CV值小于3%，488nm激光激發，用FS和SS設門，確定淋巴細胞群，分別收集525nm、620nm波長的熒光，分析陽性細胞的百分率。

1.2.3 抗氧化酶與脂質過氧化水平的測定 SOD活性、MDA含量和GSH水平測定均嚴格按照試劑盒提供的說明書操作。試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。

1.3 主要儀器和試劑

枸櫞酸鈉抗凝劑、淋巴細胞分離液購于天津市灝洋生物制品科技有限責任公司，Annexinⅴ－FITC雙染色試劑盒購于南京凱基生物科技發展有限公司，TDZ4－WS低速臺式離心機(長沙湘儀離心機儀器有限公司)，EPICSXL型流式細胞儀(美國貝克曼庫爾特公司)，ECOM－F6124型半自動生化分析儀(德國EPPENDORF公司)。

1.4 數理統計

用SPSS 15.0軟件對所獲得數據進行處理，選擇1－SampleK－S進行正態檢驗，選擇One－Way ANOVA進行單因素方差分析，用mean±SD表示結果。用P＜0.05來表示數據差異具有顯著性。

2 結果

2.1 受試者的基本情況 見表1。

2.2 萬米長跑后人體外周血淋巴細胞凋亡率的變化

與安靜狀態比較，運動后2h和24h血漿淋巴細胞凋亡率顯著升高(P＜0.01)，運動后2h顯著高于24h(P＜0.05)，48h基本恢復安靜水平，人體血漿淋巴細胞凋亡率在萬米長跑后的時序性變化特征見圖1;從血漿淋巴細胞凋亡的流式細胞儀分析圖(圖2)也可以看出同樣的趨勢。

表1 受試者基本情況一覽表

圖1 萬米跑后人體外周血淋巴細胞凋亡率的時相變化

圖2 血液淋巴細胞凋亡流式細胞儀分析圖

2.3 萬米長跑后人體外周血中SOD酶活性、GSH與MDA含量的變化

運動前安靜時相比，萬米長跑后2h和24h人體血漿中SOD酶活性顯著升高(P＜0.01)，運動后48h則五顯著變化(P＞0.05);與運動后24h相比，運動后48h人體血漿中SOD酶活性顯著下降(P＜0.05)。運動前安靜水平相比GSH水平在運動后2h顯著高升高(P＜0.05)，而運動后24h和48h則無顯著差異(P＞0.05)。與運動前安靜水平相比，MDA含量在運動后2h和24h均顯著升高(P＜0.01)，而運動后48h則無顯著差異(P＞0.05);與運動后24h相比，運動后2h顯著升高(P＜0.01)。運動前后血漿中SOD酶活性、GSH與MDA含量的時相變化見圖3、圖4、圖5。

2.4 萬米長跑后人體外周血淋巴細胞凋亡率與MDA含量的相關性

如圖6所示，萬米長跑后人體血漿MDA含量與淋巴細胞凋亡率呈正相關關系，有統計學意義(r:0.757;P:0.001)。

圖3 萬米跑后人體血漿中SOD的變化

圖5 萬米跑后人體外周血中MDA的變化

圖4 萬米跑后人體外周血中GSH的變化

圖6 人體外周血MDA含量與淋巴細胞凋亡率相關性檢驗

3 討論

細胞凋亡的概念在1972年由澳大利亞病理學家Kerr等首次提出［1］。近年來隨著細胞生物學和分子生物學的發展，細胞凋亡的研究已經成為現代醫學和生物學研究領域中的熱點。細胞凋亡是一種具有特征形態和生化改變的細胞死亡過程，其意義在于多細胞生物通過這種特殊的細胞自殺行為對不同外界有害刺激時產生應答，從而維持內環境的平衡和生長發育，細胞凋亡持續發生在機體整個生命過程［6］。運動作為一種外在刺激，勢必會影響機體內環境的穩定，近年來的研究表明，多種運動方式都可能引起機體的細胞凋亡率，而凋亡率變化也發生在多種組織細胞，比較普遍的觀點有急性、大強度運動能引起多種組織細胞的凋亡率上升，其中包括免疫細胞［5］。MoorenFC等證實在力竭運動后血淋巴細胞數目下降［7］。近年來，國內外學者也相繼發現力竭運動后胸腺細胞血淋巴細胞凋亡率顯著增加，認為這可能是導致力竭運動后免疫功能低下的主要原因［8］。

李靖等人對大鼠進行一次性力竭游泳訓練，發現一次性力竭運動能夠誘導大鼠淋巴細胞凋亡，且隨著疲勞加深凋亡細胞比例增大［4］。本研究發現，萬米長跑后，人體外周血淋巴細胞凋亡率增加，這與前人的研究是相一致的，而淋巴細胞凋亡增加可能是免疫功能低下的原因之一;本研究還發現萬米長跑后人體外周血淋巴細胞凋亡也呈現時相性特征，運動后2h和24h人體外周血淋巴細胞凋亡率顯著高于運動前安靜水平(P＜0.01)，運動后2h高于24h(P＜0.05)，48h基本恢復。在運動影響血液淋巴細胞凋亡率方面，其他學者也有相關報道，認為運動會導致運動后血液中淋巴細胞的減少，Morren通過選取健康志愿者，并對他們進行力竭性運動實驗發現，力竭運動后即刻血液中的淋巴細胞凋亡率呈顯著性增長［7］。Mars等進行力竭性跑步運動實驗，在運動后即刻、24h和48h取靜脈血，用TUNEL法染色志愿者的淋巴細胞，并采用流式細胞術對凋亡率進行檢測，與運動前的相比，發現運動后即刻有63%的淋巴細胞、運動后24h有86.2%的淋巴細胞出現凋亡［9］。Umegaki等讓志愿者在跑臺上以85%VO2max的強度運動30min，發現發生輕微的染色體損傷，而這種損傷能在次級氧化應急的誘導下加強［10］。劉曉莉等人通過DNA損傷檢測實驗也間接說明了大強度耐力運動對細胞凋亡的影響及其時序性［11］。而這種時序性特征也被國外不少學者的研究證實［12－13］。這些研究均直接或間接地證明了大強度耐力運動對機體外周血淋巴細胞的凋亡有誘發作用，從而在一定程度上解釋了長時間大強度運動后機體外周血淋巴細胞數量的減少。而大強度耐力運動后引起細胞的凋亡具有一定的時序性，與本研究的時序性特征具有一致性。與Pedersen的“Open Windows”理論也具有對應性。表明機體在大強度耐力運動后，免疫能力會大大降低，而這個低下期可能持續24h左右。但也有研究認為運動后淋巴細胞數量減少并不是由淋巴細胞凋亡產生的，但大強度耐力運動后機體免疫能力的下降得到了諸多學者的公認。

機體在有氧代謝過程中產生活性氧族(reactive oxygen species，ROS)，正常情況下，機體內ROS的產生和消除系統處于動態平衡狀態，但這種平衡狀態很容易被外界的刺激打破，從而導致ROS代謝失衡，ROS對機體產生損害作用，反映到機體就會出現氧化應激(oxidative stress)，SOD酶活性、GSH水平常用來作為反映機體的抗氧化能力，MDA作為脂質過氧化的產物其含量經常可以間接代表組織發生氧化損傷的程度。研究認為大強度耐力運動會使機體組織缺血、缺氧、ATP分解加速，使得cAMP生成增加，在黃嘌呤氧化酶作用下產生超氧陰離子自由基，同時線粒體呼吸鏈電子傳遞加快，使呼吸鏈產生大量的自由基，從而使機體的抗氧化系統被打破，大量的自由基攻擊細胞膜，造成細胞凋亡［14－15］。本實驗結果表明，萬米長跑運動后2h和24h，人體外周血中SOD酶活性與運動前水平相比顯著升高，GSH水平在運動后2h與運動前水平相比顯著升高，這可能是機體加快自由基清除的代償性反應，而對應的脂質過氧化產物MDA的含量發生顯著變化。萬米長跑運動引起體內ROS自由基生成增多，導致運動性氧應激和膜脂質過氧化，而已有的研究認為，氧化應激造成的細胞凋亡與自由基誘導細胞膜上的凋亡相關蛋白表達有關，自由基誘導細胞膜凋亡通路打開［16］。機體因ROS自由基的失衡造成內環境的穩態一旦被打破，再次恢復平衡需要一定的時間，因此在運動后24h時血液仍保持較高的氧化應激水平。隨著時間的增加，機體的ROS自由基的清除，機體抗氧化系統恢復到平衡狀態。而從機體MDA含量與淋巴細胞凋亡的相關性(r:0.757;P:0.001)可以看出，機體在大強度耐力運動后，外周血淋巴細胞凋亡的可能與大強度耐力運動產生大量的氧自由基有關。可以推斷，機體在大強度耐力運動的Open Windows與大量自由基的產生有很大關系。當然，運動后淋巴細胞的凋亡程度也會隨著運動方式、運動量以及組織器官的不同而有差異性［3］，所以目前來看，有關大強度運動引起淋巴細胞凋亡時序性的研究結果還存在差異性，詳細而準確的時序結論還需要更多的實驗驗證。

4 結論

萬米長跑對外周血淋巴細胞凋亡率有誘發效應，運動后凋亡率隨時間的變化呈現“開窗理論”特征。萬米長跑后外周血淋巴細胞凋亡率的增加可能是機體免疫能力下降的原因。大強度耐力運動引起的機體自由基代謝失衡可能是淋巴細胞凋亡率變化的原因之一。

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Effect of Lymphocytes Apoptosis and Oxidative Stress on Human Peripheral Blood Induced by 10 000meter Running

XU Guoxi
(Department of PE，Yanshan University，Qinhuangdao 066004，Hebei，China)

object:we investigated the lymphocytes apoptosis and the level of anti-oxidative status on human serum in different times after ten-thousand-meter running，and discussed the mechanism of lymphocytes apoptosis induced by endurance exercise．Method:We selected eight healthy male athletes，who participated in ten-thousand meter running in sports games．The subjects were tested twenty-four hours before exercise and 2 hours，24hours and 48 hours after exercise．We investigated the lymphocytes apoptosis on human peripheral blood by flow cytometry and detected the level of SOD，GSH and MDA in serum．Results:The results have showed that the lymphocytes apoptosis on peripheral blood cell significantly increased 2h and 24h after exercise and 2h it was significant higher than 24h．It reduced to the level of pre-exercise after 48 hours．The activity of SOD and the content of GSH and MDA in serum increased significantly at 2h compared with the pre-exercise，and SOD activity and MDA content were still significant higher than the pre-exercise．The changes of the indexes in serum at 48h had no significant difference compared with pre-exercise．A negative correlation was found between MDA and the rate of lymphocyte apoptosis．Conclusions:ten-thousand-meter running induces have effects on rates of peripheral blood lymphocytes，and the apoptosis rate changes over time show“open windows”feature．Exercise-induced metabolic imbalance of free radicals might be one of the lymphocytes apoptosis mechanisms．

lymphocytes apoptosis;oxidative stress;peripheral blood;ten-thousand-meter running

G804.7

A

1004－0560(2011)04－0086－04

2011-05-12;

2011-06-19

河北省科技廳資助項目(11457201D－10)。

許國喜(1963－)，男，副教授，學士，主要研究方向為學校體育與健康。

責任編輯:喬艷春

?體育教育訓練學