運動、IGF－I誘導骨骼肌適應性肥大的機理研究

朱 晗，趙 華，曾凡星

(1．北京體育大學運動人體科學學院，北京 100084;2．天水師范學院體育學院，甘肅天水 741001)

運動、IGF－I誘導骨骼肌適應性肥大的機理研究

朱 晗1，趙 華2，曾凡星1

(1．北京體育大學運動人體科學學院，北京 100084;2．天水師范學院體育學院，甘肅天水 741001)

目的:采用注射外源性IGF－I和一周跑臺運動，觀察對大鼠骨骼肌mTOR信號通路的影響，深入探討IGF－I對運動骨骼肌適應性肥大的機理。方法:8周齡雄性SD大鼠在適應性訓練后分為四組:安靜組(S)、安靜IGF－I組(SI)、運動組(E)、運動+IGF－I組(EI)。運動方式為跑臺運動(20m/min，10%，60min/d)，每天一次，共7天。外源性IGF－I為小腿后側肌肉隆起處的皮下注射。用Western Blotting法檢測腓腸肌MHC、PI3K、AKt、mTOR、p70S6K蛋白和Akt(Ser473)、mTOR(Ser2448)和p70S6K(Thr389)的磷酸化表達。結果:在一周后，外源性IGF－I顯著促進骨骼肌MHC的表達，骨骼肌PI3K、Akt、mTOR蛋白和Akt(Ser473)、mTOR(Ser2448)和p70S6K(Thr389)的磷酸化表達顯著增強。運動顯著促進mTOR蛋白和Akt(Ser473)、mTOR(Ser2448)和p70S6K(Thr389)磷酸化的表達。對運動的反應，上述信號的磷酸化表達高于蛋白表達。結論:1)一周外源性IGF－I注射明顯促進運動骨骼肌mTOR通路的活性;而1周跑臺運動與IGF－I具有協同增強效應。2)在運動和注射外源性IGF－I的刺激下，mTOR通路各信號分子的磷酸化表達比蛋白表達更為敏感。建議今后對信號的研究以檢測信號分子的磷酸化表達為主。

IGF－I;mTOR通路;骨骼肌肥大;運動

研究證實，磷脂酰肌醇－3激酶/蛋白激酶B/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(PI3K/Akt/mTOR)信號是骨骼肌蛋白質合成的最主要信號轉導通路［1］，近年已成為骨骼肌生理學的研究熱點之一。目前在體運動的情況下，利用增強骨骼肌中IGF－I來對肌肉內mTOR通路整個上下游信號進行的研究尚不多見，本文應用注射外源性IGF－I結合運動深入觀察mTOR信號通路變化特點，希望能較深入闡明IGF－I誘導骨骼肌肥大的機理。

1 材料與方法

1.1 研究對象與分組

健康雄性、SPF級8周齡SD大鼠，體重(177.8±5.4)g，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供。國家標準嚙齒類動物飼料，分籠飼養，4只/籠。自由飲食，溫度維持在22℃～24℃，相對濕度50%～65%。晝夜節律人工控制光照(光照時間為8:00－20:00)。大鼠經適應性訓練后，隨機分為四組:安靜組(S)、安靜IGF－I注射組(SI)、1周跑臺運動組(E)、運動+IGF－I注射組(EI)，每組6只。實驗前各組體重無顯著差異。

1.2 動物運動方案

正式運動訓練前，大鼠在跑臺上進行4天的適應性訓練，然后休息3天。適應性訓練方案見表1。

表1 動物適應性訓練方案

正式實驗研究共7天，安靜組給予常規飼養，運動組大鼠進行7天運動，運動方案為上坡跑(坡度為10%)、速度20m/min，每天訓練60min。(根據Bedford經驗公式，相當于75%VO2max)［2］。

1.3 IGF－I注射方案

在大鼠小腿后面肌腹隆起處進行皮下注射IGF－I。每次運動后即刻，安靜注射組和運動注射組在大鼠小腿后肌腹隆起處的皮下注射IGF－I。安靜和運動組分別注射同等劑量的生理鹽水。具體劑量安排如表2。

表2 IGF－I注射劑量安排表

1.4 測試樣本采集與處理

取材前禁水禁食12h，以0.3ml/100g為劑量，腹腔注射10%水合氯醛麻醉。麻醉后速取后肢腓腸肌。剔除肌腱及筋膜組織，用干凈濾紙將其吸干，用錫紙將其包裹后迅速投入液氮，于－80℃冰箱保存待測。

1.5 指標測試方法

蛋白濃度測試(Bradford)配制Bradford工作液:按照《精編分子生物學實驗指南》配制［3］。采用Western Blot方法分別測試MHC、PI3K、Akt、mTOR、p70S6K蛋白和Akt(Ser473)、mTOR(Ser2448)、p70S6K(Thr389)磷酸化表達。

Tris－甘氨酸電泳緩沖液、上樣緩沖液、電轉液、堆積膠和分離膠的配制均參照《Current protocols in protein science》實驗方法［4］，TBS、TBST、封閉液按照Cell Signaling抗體說明書的要求配制。

取100μg總蛋白配制成上樣體系，置95℃沸水中5min，再于4℃中冷卻，上樣前以3000rpm離心5min。配制分離膠6%(MHC、mTOR)、8%(PI3K、p70S6K)和10%(Akt、β－actin)，以及5%濃縮膠。濃縮膠用80V恒壓，分離膠換120V恒壓電泳。再用半干轉將蛋白轉到NC膜上，以恒壓20V半干轉。封閉90min后用加入一抗，不同抗體稀釋比例分別為β－actin(購自Santa Cruz公司)為1∶500，Fast Myosin Skeletal Heavy chain antibody［MY－32］(Abcam公司)為1∶2000，PI3K抗體(Cell Signaling公司)為1∶1200，Akt抗體(Cell Signaling公司)為1∶1500，Phospho－Akt(Ser473)(Cell Signaling公司)為1∶800，mTOR(Cell Signaling公司)為1∶1000，Phospho－mTOR(Ser2448)(Cell Signaling公司)為1∶800，p70S6K抗體(購自Cell Signaling公司)為1∶1000，Phosphop70S6K(Thr389)(Cell Signaling公司)為1∶1200，然后4℃孵育過夜。次日晨在用TBST洗膜后用不同濃度二抗室溫孵育60min。用ECL發光試劑與膜在暗室中反應、曝光。曝光底片用凝膠成像系統的透光進行拍照，用Quantity One圖像分析系統分析。將每個條帶與相應樣品的β－actin條帶光密度值進行比較，計算出目的條帶的相對含量值。

1.6 數理統計法

運用SPSS 13.0軟件對實驗檢測結果進行實驗數據處理。組間比較采用雙因素方差分析(UNIANOVA)和單因素方差分析(One－Way ANOVA)。對實驗觀測點的組間多重比較(Post Hoc)采用LSD或Tamhane’s T2方法分析。P＜0.05表示具有顯著性差異，P＜0.01表示具有非常顯著性差異。

2 結果

圖1和表3顯示:1周外源性IGF－I注射顯著促進了骨骼肌MHC表達(F=18.455，P＜0.01)，1周跑臺運動具有促進的趨勢(F=0.627，P＞0.05)。外源性IGF－I顯著促進骨骼肌 PI3K蛋白(F=10.679，P＜0.01)、Akt蛋白(F= 31.837，P＜0.01)、mTOR蛋白(F=20.114，P＜0.01)和Akt (Ser473)(F=6.978，P＜0.05)、mTOR(Ser 2448)(F= 11.307，P＜0.01)和p70S6K(Thr 389)(F=19.696，P＜0.01)的磷酸化表達。運動顯著促進mTOR蛋白(F=5.433，P＜0.05)和 Akt(Ser473)(F=19.092，P＜0.01)、mTOR (Ser2448)(F=23.942，P＜0.01)和 p70S6K(Thr 389)(F= 32.541，P＜0.01)磷酸化的表達。

圖1 IGF－I和運動干預下MHC和mTOR信號通路表達圖

表3 IGF－I和運動干預下大鼠腓腸肌MHC和mTOR通路表達值(相對含量)

實驗發現，IGF－I和運動因素間存在相互協同增強效應。具體表現為安靜IGF－I注射組(SI)和運動+IGF－I注射組(EI)的MHC均顯著高于安靜組(S)和運動組(E)(分別為18%和15.7%、23%和20.6%)。SI和EI組的PI3K均顯著高于安靜組(分別為11%和14%)，運動+IGF－I注射組顯著高于運動組(10.7%)。SI組和EI組的Akt均顯著高于S組和E組(分別為17%和15%、28%和25%)。E組和EI組的Akt(Ser473)磷酸化顯著高于S組(27%和43%)，EI組顯著高于SI組(22.2%)。SI組和EI組的mTOR均顯著高于S組(分別為18%和26%)。EI組的mTOR(Ser 2448)磷酸化顯著高于S組、SI組和E組(分別為35%、27.4%和19.5%)。EI組的p70S6K(Thr 389)磷酸化顯著高于S組、SI組和E組(分別為48%、27.6%和21.3%)，SI組和E組顯著高于S組(16%和22%)。對運動的反應:Akt蛋白和Akt (Ser473)均值分別為 1.02，1.27;mTOR蛋白和 mTOR (Ser2448)均值分別為 1.09，1.13;p70S6K蛋白和 p70S6K(Thr389)均值分別為1.06，1.22。上述指標的磷酸化表達均高于其蛋白表達。

3 討論

多年來，對IGF－I的作用已經開展了廣泛的研究，均發現IGF－I在肌肉蛋白質合成中發揮了十分重要的作用，但IGF－I誘導蛋白質合成的信號轉導機制尚不清楚。以往的研究曾認為，IGF－I可能通過鈣調信號起作用。Musaro等［5］對大鼠肌細胞進行L6MLC/IGF－1的培養，然后進行calcineurin質粒轉染，之后用鈣離子載體和環孢素A進行藥物干預。研究發現IGF－I能增強骨骼肌內鈣調信號通路，并激活GATA－2和NF－AT，從而促進骨骼肌肥大。而后續的眾多研究顯示，IGF－I只是與鈣離子通道發生協同效應，在IGF－I促進骨骼肌肥大的過程中，鈣調信號通路并非居于主導地位。Rommel等［6］用C2C12肌細胞培養，用IGF－I (10ng/ml)、A23187(0.1－10 μM)、LY294002(10μM)、雷帕霉素(20ng/ml)、CsA(5μM)、PD98059等藥物以激活或阻斷IGF－I相關的信號通路，發現在IGF－I促進骨骼肌肥大的過程中，IGF－I促進肌肉肥大主要是通過Akt所介導的信號通路來完成，并且是通過 Akt介導的 PI3K/Akt/mTOR和PI3K/Akt/GSK3通路發揮作用。

實驗研究發現，一周外源性IGF－I注射顯著促進骨骼肌MHC表達，而1周跑臺運動有促進其表達的趨勢。外源性IGF－I顯著促進骨骼肌PI3K蛋白、Akt蛋白、mTOR蛋白和Akt(Ser473)、mTOR(Ser 2448)和p70S6K(Thr 389)磷酸化表達。運動顯著促進mTOR蛋白和Akt(Ser473)、mTOR(Ser 2448)和p70S6K(Thr 389)(P＜0.01)磷酸化的表達。外源性IGF－I和運動因素間存在協同增強效應。同時本研究還發現，在運動和注射外源性IGF－I的刺激下，各信號分子的磷酸化狀態比蛋白表達表現得更為敏感。

PI3K是細胞的重要信號蛋白，在許多細胞的生存、增殖、分化、代謝過程中起著非常重要的作用［7］，并且與膜泡轉運、細胞骨架重組、細胞存活、腫瘤發生、抗凋亡等病理生理過程密切相關［8］，同時也是IGF－I介導肌肉蛋白質合成信號轉到途徑中的關鍵環節。IGF－I在對衛星細胞池進行調節的過程中，能利用多種信號通道，如鈣調磷酸酶/NFAT、促分裂蛋白激酶、磷脂酰肌醇3－激酶(PI3K)等。Coolican等人認為IGF－I激活衛星細胞產生分化是經PI3K通道的介導［9］。本研究發現，外源性的IGF－I能夠刺激PI3K蛋白表達量顯著性增加(增加約11%)，這與其他學者的研究趨于一致。目前的研究認為，生長因子等細胞外信號刺激激活PI3K主要通過兩種途徑:一是與具有磷酸化酪氨酸殘基的生長因子受體或連接蛋白相互作用，引起二聚體構象改變而激活;二是通過Ras蛋白和p110直接結合使其激活［10］。

Akt是PI3K的下游信號，其激活后可以通過下游的一系列底物促進細胞的生長、增殖等［11］。目前的研究發現IGFI可以誘導Akt磷酸化表達水平增加，并在IGF－I介導的骨骼肌纖維肥大中發揮了重要作用［6，12］。Lai等［13］通過基因轉染使成體骨骼肌持續表達有活性的Akt，2－3周后骨骼肌體積明顯增大，平均骨骼肌纖維橫斷面積增加超過兩倍，說明IGF－I下游信號Akt的激活足以引起肌肉肥大。本研究發現，對大鼠外源性注射IGF－I可以使Akt蛋白和磷酸化均增加約17%，提示IGF－I通過PI3K信號通路對Akt產生了激活效應。其具體途徑可能為:IGF－I與其受體結合活化PI3K，激活的PI3K磷酸化質膜上PIP2，產生第二信使PIP3，PIP3與細胞內含有PH結構域的信號蛋白Akt和PDK1結合，促使PDK1磷酸化Akt蛋白上Ser308位點，導致Akt的活化。Akt活化后，可抑制TSC1－TSC2，后者有抑制mTOR的功能，mTOR能促進蛋白質合成，Akt活化后抑制TSC1－TSC2，使后者對mTOR的抑制作用減弱，最終導致mTOR促進蛋白合成能力增加［14］。

mTOR對于骨骼肌的分化具有重要作用［15，16］。學者們已經通過使用雷帕霉素阻斷mTOR信號的方法對mTOR的生物學效應進行了廣泛的研究，發現阻斷mTOR信號可以阻斷運動誘導的I型和II型肌纖維肥大［1］。用雷帕霉素阻斷mTOR后，可以阻斷骨骼肌肥大效應的95%。研究發現，活化的Akt可以作用于mTOR的Ser2448位點，引起Ser2448位點的磷酸化。這一位點的磷酸化被認為是mTOR活性的標志，可以繼而引起其下游信號表達的增加［17］。本研究發現，IGF－I在促進Akt磷酸化水平顯著性提高的同時，使mTOR蛋白表達和mTOR(Ser2448)磷酸化分別增加18%和6%。

mTOR的促合成效應主要是通過對p70S6K和4EBP1活化后來實現的。p70S6K和4EBP1是mRNA翻譯的關鍵調控子，它們是mTOR的最具特征性的靶分子，其中p70S6K被認為是骨骼肌蛋白合成的重要生物標志物之一。本研究發現，一周注射外源性的IGF－I能夠刺激p70S6K(Thr389)蛋白磷酸化水平顯著性增加約16%，但p70S6K蛋白表達未見顯著變化。

本實驗發現，運動對mTOR信號通路的影響主要偏重于Akt和mTOR活性的影響。運動可能主要通過Akt來影響mTOR信號，從而影響骨骼肌內的蛋白合成過程。本研究發現，在對大鼠進行了1周75%VO2max的跑臺訓練后，于運動后6小時取材。與安靜組相比，運動組大鼠PI3K蛋白表達量增加了3%，Akt(Ser473)磷酸化水平增加27%，mTOR (Ser2448)磷酸化水平增加13%;而局部注射外源性IGF－I對骨骼肌PI3K蛋白、Akt和mTOR的活性均有顯著影響，顯示出IGF－I對整個PI3K/Akt/mTOR通路均有顯著的促進效應。而運動則可能主要通過Akt來影響mTOR信號，從而影響骨骼肌內的蛋白合成過程。

4 結論

1)一周外源性IGF－I注射明顯促進運動骨骼肌mTOR通路的活性，且為整體性;而運動與IGF－I具有協同增強效應，且運動對該通路的影響有所側重。

2)在運動和注射外源性IGF－I的刺激下，通路各信號分子的磷酸化狀態比蛋白表達更為敏感。建議以檢測信號分子的磷酸化表達為主。

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Mechanism of Exercise and IGF-I Inducing Skeletal Muscle Adaptive Hypertrophy in Rats

ZHU Han1，ZHAO Hua2，ZENG Fanxing1
(1．Sport Science College，Beijing Sport University，Beijing 100084，China;
2．Physical Education Department，Tianshui Normal University，Tianshui 741001，Gansu，China)

Objective:the purpose of this study was to examine the effect of mTOR signal pathway on Skeletal Muscle A-daptive Hypertrophy in resistance treadmill exercise model through injecting exogenous IGF-I in vivo．Methods:adult male Sprague-Dawley rats(8 weeks old)were randomly divided into 4 groups after adaptive training:sedentary(S)，IGF-I group (SI)，exercise group(E)and IGF-I plus exercise group(EI)．The following treadmill training was applied:20m/min at 10%slope，60 min;once per day，7 days．Rats were treated daily with exogenous IGF-I(5．5 mg/kg，diluted with saline)or saline local subcutaneously for 7 days．The MHC，PI3K，AKt and phosphorylation of Akt(Ser473)，mammalian target of rapamycin(mTOR)and phosphorylation of mTOR(Ser2448)，p70S6Kand phosphorylation of p70S6K(Thr 389)of gastrocnemius muscle were determined by Western blotting．Results:After 1 week，wet weight and MHC of gastrocnemius muscle was promoted significantly by IGF-I，PI3K，AKt and phosphorylation of Akt(Ser473)，mTOR and phosphorylation of mTOR(Ser2448)，p70S6Kand phosphorylation of p70S6K(Thr 389)were significantly promoted by IGF-I，and but they were elevated by exercise except PI3K．Conclusions:These results suggest that:1)The mTOR pathway of skeletal muscle was significantly promoted by exogenous IGF-I，and the positive effect was global．Exercise had synergy effect with exogenous IGF-I in vivo，while exercise can synergy improve mTOR pathway with IGF-I．The effect of exercise was particular emphasis on partial elements of mTOR pathway．2)Phosphorylations of mTOR pathway were sensitive than total-molecules．

IGF-I;mTOR pathway;skeletal muscle hypertrophy;exercise

G804.21

A

1004－0560(2011)04－0074－04

2011-06-12;

2011-07-16

國家自然科學基金項目(批準號30671013)。

朱 晗(1980－)，女，助理研究員，主要研究方向為運動生理學。

曾凡星(1956－)，男，教授，博士生導師，主要研究方向為體育運動中內分泌變化及適應機制研究，E－Mail:fanxingz@china．com．cn。

責任編輯:喬艷春

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