蛋源降血壓肽研究進展

陳琛

(陜西理工學(xué)院，陜西省資源生物重點實驗室，陜西漢中723000)

蛋源降血壓肽研究進展

陳琛

(陜西理工學(xué)院，陜西省資源生物重點實驗室，陜西漢中723000)

雞蛋不僅是人們飲食營養(yǎng)的重要來源，而且還含有許多生物活性蛋白。雞蛋活性蛋白經(jīng)酶解后會產(chǎn)生許多具有生物活性的多肽，其中最重要的就是具有降血壓活性的多肽。本文介紹了雞蛋來源的降血壓多肽的發(fā)現(xiàn)、特性、生產(chǎn)和分離及體內(nèi)外活性，以期為國內(nèi)相關(guān)研究提供參考。

高血壓，雞蛋蛋白，降血壓多肽，活性

近年來，越來越多的人已經(jīng)意識到飲食與健康之間存在著緊密的關(guān)系。因此，健康有益的功能性食品蛋白已經(jīng)成為食品市場上的一個重要部分。食物蛋白質(zhì)中包含許多生物活性肽，這些肽在母體蛋白質(zhì)序列內(nèi)不具有生物活性，通過體內(nèi)或體外化學(xué)酶水解之后可以產(chǎn)生具有一定的生物活性的多肽片段，具有生理作用的食物蛋白和肽片段已經(jīng)引起了研究者的極大興趣。雞蛋是一種營養(yǎng)豐富的完全食品，有很高的蛋白質(zhì)和豐富的脂質(zhì)，含有人體所需要的所有必需氨基酸，而且氨基酸組成合理［1］。雞蛋蛋白通過酶解后可形成具有降血壓作用的小肽，這些小肽作為功能食品的主要成分，可開發(fā)降血壓類功能食品，或成為化學(xué)合成藥物的替代品［2］。文章主要概述了雞蛋來源的降血壓多肽的發(fā)現(xiàn)、來源、生產(chǎn)與分離、活性與結(jié)構(gòu)之間關(guān)系，是國內(nèi)首篇關(guān)于雞蛋降血壓多肽的綜述，以期為雞蛋來源的降血壓多肽研究開發(fā)提供參考。

1 雞蛋組成

雞蛋是一種營養(yǎng)豐富，易被消化吸收的食物，含有很高的蛋白質(zhì)和豐富的脂質(zhì)，含有人體所需要的所有必需氨基酸，而且氨基酸組成合理。雞蛋的組成具體見表1。

雞蛋蛋白是飲食中一個非常重要的氮來源物。雞蛋蛋清和蛋黃中蛋白質(zhì)含量特別高，表2列出蛋清和蛋黃中存在的主要蛋白種類。

表2 雞蛋蛋白中的蛋白特點和性質(zhì)

2 雞蛋抗高血壓肽

1995年從雞蛋中發(fā)現(xiàn)第一個降血壓肽Ovokinin后，到目前已經(jīng)報道了不少于16種雞蛋來源的降血壓多肽，其中通過結(jié)構(gòu)設(shè)計及化學(xué)合成1種;其余的通過酶解得到。酶解得到的降血壓多肽具體見表3。

2.1 卵清蛋白源降血壓肽

卵清蛋白(Ovalbvmin)，是一種糖蛋白，分子量約45.0ku，氨基末端是甘氨酸，但其氨基被乙酞化，羧基末端為脯氨酸。第一個蛋源降血壓肽是來源于卵清蛋白。1995年Fujita等［4］通過酶解方法，從卵清蛋白分離了一個抗高血壓八肽，氨基酸序列是Phe-Arg-Ala-Asp-His-Pro-Phe-Leu(FRADHPFL)，命名為Ovokinin，屬于血管緊張素轉(zhuǎn)化酶 I抑制劑(Angiotensin I-converting enzyme inhibitory peptide，ACE)。Ovokinin的序列相當(dāng)于卵白蛋白(egg albumen)的第358～365個氨基酸。Ovokinin對犬腸系膜動脈具有內(nèi)皮依賴性舒血管活性，EC50= 18μmol/L。它的作用部分是通過調(diào)節(jié)B1受體，刺激環(huán)前列腺素釋放。通過動物實驗發(fā)現(xiàn)高劑量的Ovokinin對原發(fā)性高血壓大鼠 (spontaneously hypertensive rat，SHR)具有抗高血壓活性，Ovokinin通過卵黃混合后口服飼喂，對SHR血壓降低更明顯，推測可能是當(dāng)卵黃包裹Ovokinin后，雞蛋中的卵磷脂改善了腸道對Ovokinin的吸收，或是保護Ovokinin肽受腸肽酶消化水解［5］。

表1 雞蛋組成［3］

表3 通過酶解從雞蛋蛋白中獲得的抗高血壓活性肽

第二個蛋源降血壓肽是一個具有舒張血管作用的六肽，是Ovokinin的第2～7個氨基酸組成的片段，并命名為Ovokinin2-7，序列為:Arg-Ala-Asp-His-Phe-Leu(RADHPF)。1999年，Matoba等［6］用胰凝乳蛋白酶(Chymotrypsin)水解雞卵清蛋白，分離純化得到Ovokinin2-7，并發(fā)現(xiàn)Ovokinin2-7序列對應(yīng)的是卵白蛋白的第359～364個氨基酸。Ovokinin2-7有對SHR鼠腸系膜動脈內(nèi)皮依賴性舒血管活性，并且舒張血管受NO調(diào)節(jié)。口服Ovokinin2-7對SHR鼠有降血壓作用，并且在高劑量下才起效，但是對正常血壓大鼠(Wistar-Kyoto rats，WKY)動脈不能產(chǎn)生舒張作用，靜脈注射Ovokinin2-7對大鼠的血壓沒有影響，注射高濃度的Ovokinin2-7僅能引起SHR鼠血壓輕微的降低。Scruggs等［7］研究了Ovokinin2-7的作用機制，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Ovokinin2-7是通過激活緩激肽B2受體產(chǎn)生調(diào)節(jié)血管作用。

Fujita等建立用胃蛋白酶(pepsin)和嗜熱菌蛋白酶(thermolysin)水解卵清蛋白來獲得具有ACE抑制活性的水解產(chǎn)物，兩個水解產(chǎn)物的ACE IC50分別為45.0mg/L和83.0mg/L。然后，從胃蛋白酶水解產(chǎn)物中分離純化得到6個具有ACE抑制活性的多肽，IC50從0.4到15μmol/L。但是，動物實驗研究結(jié)果表明，這6個多肽中僅有含兩個氨基酸的二肽Leu-Trp (LW)對SHR鼠具有抗高血壓活性。

2.2 卵清源降血壓肽

蛋清中的蛋白質(zhì)主要有卵清蛋白(Ovalbumin)、卵鐵轉(zhuǎn)運蛋白 (Ovotransferrin)、卵類粘蛋白(Ovomucoid)、溶菌酶 (Lysozyme)、卵粘蛋白(Ovomucin)、半胱氨酸蛋白酶抑制劑(Cystatin)和抗生物素蛋白(Avidin)。蛋清用于生產(chǎn)降血壓多肽的優(yōu)點在于來源豐富，成本低廉。

Miguel等［14］報道雞蛋蛋清通過胃蛋白酶水解處理3h，獲得序列為Tyr-Arg-Glu-Glu-Arg-Tyr-Pro-Ile-Leu(YAEERYPIL)，Arg-Ala-Asp-His-Pro-Phe -Leu(RADHPFL)和Ile-Val-Phe(IVF)，3個多肽具有ACE抑制活性，這3個多肽的IC50分別是4.7，6.2和33.11μmol/L，通過口服飼喂給SHR鼠后血壓急劇下降，飼喂給血壓正常的WKY鼠的血壓沒有變化。將以上3個多肽、蛋清、蛋清水解產(chǎn)物口服飼喂SHR鼠比較研究結(jié)果，3個多肽降血壓效果比蛋清、蛋清水解降血壓效果好。長期給SHR鼠飼喂蛋清水解產(chǎn)物可以預(yù)防SHR鼠高血壓的發(fā)展，由此表明蛋清水解產(chǎn)物可以用于開發(fā)降血壓功能性食品。

2.3 卵黃源降血壓肽

Yoshii等(2001)用不同的粗酶水解雞蛋卵黃生產(chǎn)了具有抗高血壓活性的寡肽(Oligopeptides)，分子量約為1ku，體外活性測定具有抑制血管緊張肽轉(zhuǎn)換酶活性。以20、100和500mg/kg·體重的劑量飼喂給SHR鼠，12周后SHR鼠血壓大幅下降。

3 生物活性與結(jié)構(gòu)之間的關(guān)系

口服給藥是臨床上最常用的給藥方法之一，簡便易行，痛苦小，安全性高，在各種疾病的治療中廣泛應(yīng)用。但影響蛋源降血壓肽口服后生物藥效和活性發(fā)揮的因素較多。如技術(shù)因素、加工處理影響、生理因素、胃腸酶的消化等，研究人員試圖通過結(jié)構(gòu)修飾改善多肽的口服活性。

Yamada研究團隊長期致力于雞蛋降血壓多肽的研究，在雞蛋降血壓多肽的活性改進方面做了大量的工作。Matoba等［15］基于Ovokinin2-7模板結(jié)構(gòu)進行了優(yōu)化設(shè)計，化學(xué)合成了幾個Ovokinin2-7的衍生物，增加了降血壓活性。去掉Ovokinin2-7 N端第一個氨基酸Arg后形成的5肽(RADHPF)無降血壓活性，所以推測N端Arg非常重要，可能起降血壓作用。基于Ovokinin2-7結(jié)構(gòu)設(shè)計保留了N端Arg，用Pro替代N端第2位Ala形成［Pro2］-Ovokinin2-7在100mg/kg劑量下無降血壓活性。但是通過同時替代第2位、3位氨基酸形成［Pro2，Phe3］-Ovokinin2-7 (RPFHPF)對SHR口服有效劑量為0.3mg/kg，活性較Ovokinin2-7提高33倍。

Yamada等［16］又以［Pro2，Phe3］-Ovokinin2-7 (RPFHPF)為模板肽，試圖從C端進行結(jié)構(gòu)設(shè)計而改進活性，為其遺傳操作奠定基礎(chǔ)。從C端第一個氨基酸逐一替代引入不同的氨基酸，先后合成14個［Pro2，Phe3］-Ovokinin2-7衍生物。最終發(fā)現(xiàn)RPLKPW 序列的降血壓活性在［Pro2，Phe3］-Ovokinin2-7基礎(chǔ)上，又提高 3.2倍，并命名為Novokinin。通過一系列的氨基酸替代 Novokinin的降血壓活性比Ovokinin2-7提高100倍。Novokinin對消化道蛋白酶的水解作用有很好的耐受或抵抗作用，作用機制是通過血管緊張素Ⅱ(angiotensinⅡ，AngⅡ)受體AT2和前列腺素IP受體發(fā)揮作用［17］。Miguel等［17］(2007)研究RADHPFL去掉C端2個氨基酸后RADHP五肽舒張血管的作用提高50%。對十肽YRGGLEPINF多種衍生物研究中發(fā)現(xiàn)N端YR和C端NF主要起舒張血管的作用，N端二肽YR在體外血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制活性中起重要作用。

通過脂質(zhì)體制備成脂質(zhì)微囊可保護降血壓多肽通過胃腸道時被消化，從而改進蛋源降血壓多肽的活性。有的研究通過修飾肽結(jié)構(gòu)，形成二硫橋而改進活性。利用轉(zhuǎn)基因方法將高活性的雞蛋降血壓多肽序列轉(zhuǎn)到食品蛋白質(zhì)中，生產(chǎn)降血壓食物，Yamada等(2008b)將Novokinin轉(zhuǎn)到大豆種子中，生產(chǎn)含Novokinin的轉(zhuǎn)基因大豆［18］。

4 生產(chǎn)制備及分離

雞蛋來源的降血壓肽的生產(chǎn)制備可采用酶水解法和化學(xué)合成法。從表3可以看出，酶水解使用的酶種類包括:胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶和蛋白酶與脂肪酶的混合液，其中使用最多的是胃蛋白酶，活性最強的水解產(chǎn)物是用胃蛋白酶水解雞蛋蛋清后所得組分［17］，用胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶水解后生產(chǎn)的水解產(chǎn)物降血壓活性差，這些IC50值實際上大于1000mg/L。

酶水解作用時間對活性的影響較大，酶作用時間也非常重要，胰蛋白酶或胰凝乳蛋白酶水解雞蛋蛋清蛋白獲得有活性的水解產(chǎn)物，需要的最低作用時間是24h。胃蛋白酶水解雞蛋蛋清超過3h時產(chǎn)生的水解產(chǎn)物具有一定的ACE抑制活性，其IC50為55mg/L。

化學(xué)合成也是多肽生產(chǎn)的一個重要方法，雞蛋降血壓肽氨基酸數(shù)目少，化學(xué)合成相對容易，成本較低。例如，基于Ovokinin(2-7)的結(jié)構(gòu)設(shè)計化學(xué)合成了新的、活性更強的蛋源降血壓肽Novokinin。

雞蛋來源的降血壓肽分離純化技術(shù)可采用超濾、高效液相色譜分離純化，然后用質(zhì)譜法分析純化多肽的氨基酸序列或采用液質(zhì)聯(lián)用分離鑒定。Miguel等(2005)利用超濾技術(shù)分離蛋清酶解物，分子量小于3ku的酶解組分比大分子量酶解組分的降血壓肽作用更強。

5 展望

雞蛋來源的降血壓多肽預(yù)防和治療高血壓疾病具有一定的可能性，作為降血壓功能性食品添加劑的前景更為廣闊。我們相信隨著雞蛋來源的降血壓多肽的深入研究，安全性、有效性及副作用逐漸被研究透徹后，蛋源降血壓肽將在人類高血壓的預(yù)防、治療上起到更大的作用。

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Advance in the antihypertensive peptides derived from egg protein

CHEN Chen
(Shaanxi Key Laboratory of Resource Biology，Shaanxi University of Technology，Hanzhong 723000，China)

It is widely recognized that the eggs are more than a source of dietary nutrients，and extensive studies identifying and characterizing the biologically active components of eggs have been carried out.A lot of biologically active peptides can be produced from egg proteins by hydrolysis，in which the most important peptide is antihypertensive peptides.This review outlined the discovery of antihypertensive peptides derived from egg protein，properties，production，purification，structure and activities in vitro and in vivo，and offered some references for the related research in China.

hypertension;egg proteins;antihypertensive peptides;activity

TS201.2+1

A

1002-0306(2011)03-0429-04

2010-01-20

陳琛(1978-)，男，碩士，講師，主要從事生物活性肽研究。