綠豆提取液的抗內毒素作用及提取工藝優化

李 健，王 旭，劉 寧，陳姝娟

(哈爾濱商業大學食品工程學院，黑龍江哈爾濱150076)

綠豆提取液的抗內毒素作用及提取工藝優化

李 健，王 旭，劉 寧，陳姝娟

(哈爾濱商業大學食品工程學院，黑龍江哈爾濱150076)

研究了綠豆提取液對細菌內毒素的清除作用，利用終點顯色基質法測定內毒素的含量。結果表明，綠豆提取液在體外具有抗內毒素的作用，并以內毒素的清除率為標準，探討了不同提取因素對提取效果的影響，最終確定提取條件為乙醇濃度70%，溫度60℃，提取時間2h，料液比1∶20，提取物中抗內毒素有效成分含量最高。最后通過兩相萃取分離，發現綠豆中抗內毒素成分主要集中在正丁醇提取物中。

綠豆，抗內毒素，提取

1 材料與方法

1.1 材料與設備

綠豆 市售;無水乙醇、石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇等 均為國產分析純;鱟試劑盒 廈門鱟試劑廠。

DWF-100型植物粉碎機 溫嶺市林大機械有限公司;R-205型旋轉蒸發儀 上海申勝生物技術有限公司;LD4-2A型離心機 北京醫用離心機廠;721型分光光度計 上海光譜儀器有限公司;JD5000-2型分析天平 沈陽龍騰電子有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 工藝流程 綠豆→磨粉→過100目篩→70%乙醇60℃水浴回流→三層紗布過濾→濾液離心→50℃減壓濃縮→真空干燥→綠豆總提取物→鱟實驗

1.2.2 測定方法 終點顯色法測內毒素的含量［4］。

1.2.3 細菌內毒素標準曲線的繪制

1.2.3.1 濃度的稀釋 取細菌內毒素工作品1支，用細菌內毒素工作品用水稀釋為10EU/mL的內毒素溶液，再稀釋為1.0EU/mL的內毒素溶液，以1.0EU/mL的內毒素溶液為母液依次稀釋為 1.0、0.5、0.25、0.1EU/mL的濃度梯度。

1.2.3.2 操作方法 取無熱源試管，分別加入200μL 10EU細菌內毒素溶液和綠豆提取液，55±2℃水浴37min，再加入鱟試劑溶液，混勻，溫浴37min。再加入500μL偶氮化試劑1溶液，混勻。再依次加入偶氮化試劑2和偶氮化試劑3各500μL，混勻，靜置5min，于545nm波長處讀取吸光度值，吸光度值越小說明提取液的內毒素清除率最高。

1.2.4 綠豆提取液萃取工藝研究 以綠豆提取液的內毒素清除率為標準，探討乙醇濃度、提取溫度、時間、物料比對提取工藝的影響，確定最佳提取工藝條件。

1.2.4.1 乙醇濃度對萃取效果的影響 稱取綠豆干粉5份，以1∶10的比例分別加入30%、50%、70%、80%、90%的乙醇，60℃水浴回流提取4h，過濾，低于50℃濃縮，進行鱟實驗，測吸光度值。

1.2.4.2 溫度對對萃取結果的影響 稱取綠豆干粉5份，以1∶10的比例加入60%的乙醇，分別在40、50、60、70、80℃水浴回流提取4h，過濾，低于50℃濃縮，進行鱟實驗，測吸光度值。

1.2.4.3 提取時間對萃取效果的影響 稱取綠豆干粉5份，以1∶10的比例加入70%的乙醇，60℃水浴回流，提取時間分別為2、3、4、5、6h，過濾，低于50℃濃縮，進行鱟實驗，測吸光度值。

1.2.4.4 料液比對萃取效果的影響 稱取綠豆干粉5份，分別以1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25的比例加入60%的乙醇，60℃水浴回流提取4h，低于50℃濃縮，進行鱟實驗，測吸光度值。

1.2.5 不同溶劑萃取物對內毒素的清除作用 取乙醇提取物，用蒸餾水溶解。用石油醚萃取三次除脂類，分別用三氯甲烷、乙酸乙酯和正丁醇萃取三次，濃縮各部分，進行鱟實驗。

2 結果與討論

2.1 內毒素標準曲線的繪制

見圖1。

圖1 內毒素的標準曲線

2.2 乙醇濃度對萃取效果的影響

吸光度值越小，內毒素殘留越少，提取物的清除內毒素作用效果越好，說明綠豆提取物中含有的抗內毒素成分就越多。由圖2可以看出，隨著乙醇濃度的不斷增大，綠豆中抗內毒素活性成分呈現先增多后減少的趨勢，當乙醇濃度為70%時，提取效果最佳。當乙醇濃度超過70%時，提取物中有效成分減少，這可能是由于其他醇溶性物質增加，與有效成分競爭同乙醇-水分子結合，從而導致有效成分的提取量下降。

圖2 乙醇濃度對萃取效果的影響

2.3 提取溫度對萃取結果的影響

溫度對于提取率有非常顯著的影響。由圖3可以看出，在40～60℃時，隨著溫度的升高，綠豆中抗內毒素成分不斷地被萃取出來。當超過60℃時，達到了乙醇的沸點，提取溫度太高，使其中的活性成分破壞，且雜質的溶出量增加。因此，最佳萃取溫度定為60℃。

圖3 提取溫度對萃取結果的影響

2.4 提取時間對萃取結果的影響

由圖4可以看出，萃取時間越長，萃取效果越好。2h后，曲線下降緩慢。從綜合提取效率方面考慮，提取時間定為2h。

圖4 提取時間對萃取結果的影響

2.5 料液比對萃取結果的影響

乙醇能穿透綠豆粉末的細胞膜，溶解溶質，形成細胞內外溶質濃度差，將溶質滲出細胞膜，達到提取目的。料液比越大，滲透壓越大，溶質更容易溶出。由圖5可以看出，當料液比在1∶20之后，料液比對提取效果影響不大，曲線變緩，考慮到實驗條件的影響，確定料液比為1∶20。

圖5 料液比對萃取結果的影響

2.6 不同溶劑萃取物對內毒素的清除作用

由圖6可知，乙醇提取物經過不同的溶劑萃取，正丁醇的萃取物對內毒素的清除作用最強。由此可以斷定，綠豆中清除內毒素的有效成分主要集中于正丁醇萃取物中。

3 結論

綠豆提取液具有體外清除細菌內毒素的作用，不同的提取條件均能影響提取物中清除內毒素有效成分的含量。經研究利用70%的乙醇，料液比1∶20，60℃條件下提取2h，綠豆中清除內毒素的有效成分提取效果理想。通過兩相萃取，證明有效成分主要集中于正丁醇提取物中。

圖6 不同溶劑萃取物對內毒素的清除作用

［1］趙守訓，黃泰康，丁志尊.中藥辭海［M］.第三卷.北京:中國醫藥科技出版，1997:642-643.

［2］沈連生主編.本草綱目［M］.北京:華夏出版社，2004:199.

［3］雷黎明，潘清平.板藍根化學、藥理、質量及提取方法的研究進展［J］.時珍國醫國藥，2007，18(10):2579.

［4］國家藥典委員會.中華人們共和國藥典［M］.第一部.北京:化學工業出版社，2005:79.

Study on anti-endotoxin of mung bean extraction and optimization of extraction processing

LI Jian，WANG Xu，LIU Ning，CHEN Shu-juan
(College of Food Engineering，Harbin Commerce University，Harbin 150076，China)

The clearing effect of extraction from mung bean on the bacterial endotoxin was investigated in vitro.The results indicated that extraction from mung bean could clear the bacterial endotoxin in vitro with displaying color in the end.And the influences of different factors on extracted efficiency were discussed.The conditions of 60℃，70% ethanol，solid-liquid ratio of 1∶20，extracting for 2h were optimized.And it was found that the effective components existed in the extraction of chloroform through extracting in the two-phase.

mung bean;anti-endotoxin;extraction

TS201.1

A

1002-0306(2011)03-0310-03

綠豆(Mung bean)，又名青小豆、錄豆、植豆，為一年生草本植物的種子。綠豆性味甘寒，具有清熱解毒之功效。《開寶本草》記載［1］:“綠豆，甘，寒，無毒。入心、胃經。主丹毒煩熱，風疹，熱氣奔豚，生研絞汁服，亦煮食，消腫下氣，壓熱解毒”。《精編本草綱目》云［2］:“綠豆，消腫治痘之功雖同于赤豆，而壓熱解毒之力過之。且益氣、厚腸胃、通經脈，無久服枯人之忌。外科治癰疽，有內托護心散，極言其效”。內毒素即脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)，由保守的毒性脂質A部分、核心糖脂和特異的O側鏈組成，是革蘭陰性菌細胞壁的主要成分。內毒素侵入機體血流，可觸發體內一系列病理生理過程而引起發熱、膿毒性休克、彌漫性血管內凝血以致死亡，中醫把LPS看成“熱毒”“邪毒”的物質基礎。現代研究認為，中藥材的清熱解毒功效主要集中于有效成分抗內毒素作用和抗病原微生物作用［3］。本文主要研究了綠豆提取液的體外抗內毒素作用，并以內毒素的清除率為指標，對提取液的制備工藝進行了優化。

2010-05-27

李健(1956-)，男，教授，主要從事食品化學方面的研究。

黑龍江龍泰農業股份有限公司橫向課題。