超聲-琥珀酰化復合改性提高大豆分離蛋白乳化性的研究

李 磊，遲玉杰，2，*，王喜波，于 濱

(1.東北農業大學食品科學學院，黑龍江哈爾濱150030; 2.大豆生物學教育部重點實驗室，黑龍江哈爾濱150030)

超聲-琥珀酰化復合改性提高大豆分離蛋白乳化性的研究

李 磊1，遲玉杰1，2，*，王喜波1，于 濱1

(1.東北農業大學食品科學學院，黑龍江哈爾濱150030; 2.大豆生物學教育部重點實驗室，黑龍江哈爾濱150030)

為提高大豆分離蛋白的乳化性，采用超聲和琥珀酰化兩種方法對大豆分離蛋白進行復合改性。通過單因素實驗研究底物濃度、超聲功率、超聲時間、琥珀酸酐添加量和酰化反應溫度對大豆分離蛋白乳化性的影響。在單因素實驗的基礎上，運用響應面法優化出超聲-琥珀酰化改性大豆分離蛋白的適宜條件:超聲功率569.36W、超聲時間9.79min、酰化溫度49.72℃。該條件下制得的改性大豆分離蛋白的乳化活性和乳化穩定性與未改性的大豆分離蛋白相比較，分別提高了3.05倍和4.65倍。

大豆分離蛋白，超聲波處理，琥珀酰化，乳化性，響應面法

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大豆分離蛋白 哈高科大豆食品有限責任公司，蛋白質含量87.11%，水分含量5.84%，脂肪含量1.95%，灰分含量4.92%;琥珀酸酐 國藥集團化學試劑有限公司;大豆油 北海糧油工業(天津)有限公司;十二烷基磺酸鈉(SDS) 化學純;其他試劑均為分析純。

290型噴霧干燥機 瑞士BüChi公司;JY92-2D超聲儀 寧波新芝生物科技股份有限公司;FS-1可調高速勻漿機 金壇市榮華儀器制造有限公司;722型分光光度計 天津市普瑞斯儀器有限公司; LD4-2A型離心機 北京醫用離心機廠;其它儀器均為實驗室常規儀器。

1.2 實驗方法

1.2.1 超聲-琥珀酰化大豆分離蛋白的制備 將SPI配成一定濃度的蛋白液，置于隔音箱中，將超聲儀探頭插入蛋白液面2cm，在超聲波作用下處理一定時間(溫度控制在20～30℃)，然后將蛋白液置于恒溫水浴鍋中，保持一定溫度，用1mol/L NaOH溶液調節pH至8.0～8.5，在攪拌的條件下分批加入琥珀酸酐，反應過程中用2mol/L NaOH溶液調節pH保持在8.0～8.5范圍內，待pH穩定30min后，反應結束，進行離心水洗:調節蛋白液pH至4.0，攪拌30min，4000r/min離心20min，取沉淀部分，重復離心水洗。水洗三次后回調pH至7.0，噴霧干燥即得超聲-琥珀酰化SPI。

1.2.2 乳化性的測定［12］蛋白樣品以0.2%(W/V)的濃度溶解于pH7.0，0.1mol/L的磷酸鹽緩沖溶液中，取30mL蛋白液加入10mL大豆油，10000r/min均質1min以形成乳化液，分別在均質后0、10min時從底部吸取100μL，用10mL 0.1%(W/V)的SDS稀釋后在500nm(OD500)條件下測定吸光值，以0min時的吸光值表示乳化活性(EA)，乳化穩定性(ES)用乳化穩定指數(ESI)表示:

式中:A0為0min時的吸光值;ΔT為時間差，本實驗中是10min;ΔA為ΔT內的吸光值差。

1.2.3 單因素實驗

1.2.3.1 底物濃度對超聲-琥珀酰化SPI乳化性的影響 超聲功率為500W，超聲時間10min，琥珀酸酐添加量為SPI干基的10%，酰化反應溫度40℃，底物濃度取2%、4%、6%、8%、10%考察反應后各蛋白樣品的乳化活性和乳化穩定性。

1.2.3.2 超聲功率對超聲-琥珀酰化SPI乳化性的影響 底物濃度為6%，超聲時間10min，琥珀酸酐添加量為SPI干基的10%，酰化反應溫度40℃，超聲功率取150、300、450、600、750W考察反應后各蛋白樣品的乳化活性和乳化穩定性。

1.2.3.3 超聲時間對超聲-琥珀酰化SPI乳化性的影響 底物濃度為6%，超聲功率500W，琥珀酸酐添加量為SPI干基的10%，酰化反應溫度40℃，超聲時間取4、7、10、14、17min考察反應后各蛋白樣品的乳化活性和乳化穩定性。

1.2.3.4 琥珀酸酐添加量對超聲-琥珀酰化SPI乳化性的影響 底物濃度為6%，超聲時間為10min，超聲功率500W，酰化反應溫度40℃，琥珀酸酐添加量分別取SPI干基的1%、5%、10%、15%、20%考察反應后各蛋白樣品的乳化活性和乳化穩定性。

1.2.3.5 琥珀酰化反應溫度對超聲-琥珀酰化SPI乳化性的影響 底物濃度取6%，超聲時間為10min，超聲功率500W，琥珀酸酐添加量為SPI干基的10%，酰化反應溫度取20、30、40、50、60℃考察反應后各蛋白樣品的乳化活性和乳化穩定性。

1.2.4 響應面實驗設計 在單因素實驗基礎上，根據Box-Behnken實驗設計原理，以超聲時間A、超聲功率B、酰化反應溫度C為自變量，以乳化活性為響應值，設計了三因素三水平的響應面分析實驗。對實驗數據結果采用Design-Expert7.1軟件進行分析。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗分析

2.1.1 底物濃度對超聲-琥珀酰化SPI乳化性的影響 從圖1可以看出，隨著底物濃度的增加，SPI的乳化活性和乳化穩定性顯著增加，當底物濃度大于6%時，乳化活性和乳化穩定性則呈下降趨勢。當底物濃度逐漸增大時，超聲波的空化作用增強，使SPI的分子展開，疏水基團朝向脂質而極性部分朝向水相，從而使得SPI乳化性提高;在酰化反應中，當底物濃度增大時，處于溶解狀態的SPI分子較多，單位體積溶液中能與琥珀酸酐發生有效碰撞的SPI分子數量增多，反應速度呈上升趨勢，乳化性提高。當底物濃度繼續增大時，在相等時間內，超聲波空化作用減弱，SPI分子結構改變程度變小，導致乳化性下降;并且，在酰化反應體系中，濃度增加到一定程度，呈不溶狀態的SPI分子增多，不能與琥珀酸酐分子發生有效碰撞［13］，酰化反應速度降低，導致SPI乳化活性和乳化穩定性下降。選取6%為適宜的底物濃度。

圖1 底物濃度對SPI乳化性的影響

2.1.2 超聲功率對超聲-琥珀酰化SPI乳化性的影響 從圖2可以看出，隨著超聲功率的增大，SPI的乳化活性和乳化穩定性呈上升的趨勢，在超聲功率達到600W時，乳化活性和乳化穩定性達到最高值。超聲波處理使SPI分子展開，結構變得疏松，琥珀酸酐分子和SPI的反應基團更容易結合，從而提高SPI的乳化活性和乳化穩定性。功率繼續增大，超聲波作用增強使得SPI變性程度增大，不溶性SPI的含量增多，導致SPI乳化性下降。選取600W為適宜的超聲功率。

2.1.3 超聲時間對超聲-琥珀酰化SPI乳化性的影響 從圖3中可以看出，在4～10min范圍內，隨著超聲時間的延長，SPI的乳化活性和乳化穩定性逐步上升，當超聲處理時間達到10min后，SPI的乳化性呈下降趨勢。因此，選取10min為適宜的超聲處理時間。

表3 乳化活性的實驗結果方差分析表

圖2 超聲功率對SPI乳化性的影響

圖3 超聲時間對SPI乳化性的影響

2.1.4 琥珀酸酐添加量對超聲-琥珀酰化SPI乳化性的影響 從圖4可以看出，隨著琥珀酸酐添加量的增大，SPI的乳化活性和乳化穩定性也逐步增大。琥珀酸酐添加量的增大使得引入的親水基團增多，SPI溶解度增大，從而提高了其乳化活性;琥珀酰化SPI凈負電荷的增加，亞基的伸展，使得形成的乳狀液中液珠的排斥作用增大，液珠不易聚結，從而提高了SPI的乳化穩定性。當琥珀酸酐添加量達10%以后，乳化活性及乳化穩定性增加幅度趨于平緩，其原因可能是琥珀酸酐的用量增加到一定程度時，相對于蛋白質分子而言，已趨于飽和，此時再增加琥珀酸酐的用量，對反應的促進作用減小［14］。從經濟角度考慮，確定后續實驗的琥珀酸酐添加量為SPI的10%。

2.1.5 酰化溫度對超聲-琥珀酰化SPI乳化性的影響 從圖5可以看出，隨著酰化反應溫度的升高，溶液運動的速率增加，SPI分子的伸展程度較高，有利于琥珀酸酐酰化反應的進行，溶解度增大，使得乳化活性和乳化穩定性呈上升趨勢。溫度達到60℃時，SPI分子變性程度過大，失去反應活性，導致乳化活性和乳化穩定性下降。因此選取50℃為適宜的酰化反應溫度。

圖4 琥珀酸酐添加量對SPI乳化性的影響

圖5 酰化溫度對SPI乳化性的影響

2.2 超聲-琥珀酰化SPI乳化活性的響應面分析

通過單因素實驗，確定了響應面實驗因素的0水平為:底物濃度為6%，琥珀酸酐的添加量為SPI的10%，酰化反應的pH控制在8.0～8.5范圍內。實驗的因素和水平取值見表1。

表1 響應面實驗因素水平表

響應面設計方案和實驗結果見表2，利用Design -Expert7.1軟件對實驗結果進行二次回歸分析，計算SPI乳化活性Y的回歸方程并進行方差分析(見表3)。乳化活性Y的標準回歸方程為:

由表3的方差分析結果可以看出，所得回歸方程極顯著，且失擬檢驗不顯著，這說明用方程Y擬合3個因素與乳化活性之間的關系是可行的。從3因素對超聲-琥珀酰化SPI的乳化活性的影響來看，Y回歸方程的一次項A、B對超聲-琥珀酰化SPI的乳化活性均有顯著影響，并且二次項A2、B2、C2以及交互項中的AC也對乳化活性有顯著的影響，其他因素影響不顯著，這表明響應值的變化相當復雜，各個實驗因素對響應值的影響呈二次關系，且3因素之間存在交互作用。對回歸方程進行中心標準化處理，回歸方程Y一次項回歸系數的絕對值大小均依次為B、A、C，表明3個因素對乳化活性影響順序均為:超聲功率＞超聲時間＞酰化溫度。

表2 響應面設計方案和實驗結果

分別將模型中的超聲時間(A)、超聲功率(B)、酰化溫度(C)的其中一個因素固定在0水平，得到另外兩個因素交互作用對乳化活性Y的子模型，并根據模型分別繪制響應面圖，見圖6。

圖6 超聲-琥珀酰化SPI乳化活性的響應面圖

通過響應面圖可以直觀地反映實驗條件對超聲-琥珀酰化SPI乳化活性的影響。從圖6可以看出，3個因素與Y呈拋物線關系，隨著各因素值的增加，Y先呈不同程度的上升，但當各因素達到一定的值后，繼續增加，Y呈下降趨勢，這與單因素的實驗結果相同。并且由圖6b和圖6c可以看出，在實驗溫度范圍內，與超聲時間和超聲功率兩個因素相比較，酰化溫度對SPI乳化活性的影響相對較小。

2.3 驗證實驗

通過模型，采用Design-Expert 7.1軟件優化反應條件，得出超聲-琥珀酰化復合改性提高SPI乳化活性的最適工藝條件為:超聲功率569.36W、超聲時間9.79min、酰化溫度49.72℃、底物濃度6%、琥珀酸酐添加量10%、pH8.0～8.5。在此條件下，超聲-琥珀酰化SPI乳化活性(OD500)的預測值為0.977，而實際測得超聲-琥珀酰化SPI的乳化活性(OD500)為0.962，實際值與預測值之間的相對誤差在±1%以內，說明采用響應面法優化得到的工藝條件準確可靠，按照建立的模型進行預測實際實驗是可行的。

由表4可以看出，超聲-琥珀酰化復合改性能有效提高SPI的乳化性。通過超聲和琥珀酰化復合改性制得的SPI與未改性的SPI相比較，乳化活性和乳化穩定性均有著大幅度的提高，分別提高了3.05倍和4.65倍。

表4 琥珀酰化SPI與未改性SPI乳化活性和乳化穩定性的比較

3 結論

3.1 通過響應面分析得出各因素對超聲-琥珀酰化SPI乳化活性的影響順序為:超聲功率＞超聲時間＞酰化溫度。

3.2 利用響應面法優化得到超聲-琥珀酰化SPI乳化活性的工藝條件為:超聲功率569.36W、超聲時間9.79min、酰化溫度 49.72℃。該條件下制備的超聲-琥珀酰化SPI的乳化活性(OD500)為0.962，與預測值的相對誤差在±1%以內，說明利用本實驗建立的模型的優化結果與實際情況吻合。

3.3 超聲-琥珀酰化復合改性能有效提高SPI的乳化性。通過優化得到的工藝條件制備的超聲-琥珀酰化SPI與未改性的SPI相比較，乳化活性和乳化穩定性分別提高了3.05倍和4.65倍。

［1］李里特.大豆加工與利用［M］.北京:化學工業出版社，2002:145-146.

［2］海日罕，遲玉杰.微波輔助磷酸化改性提高大豆分離蛋白乳化性的研究［J］.中國糧油學報，2009，24(6):36-40.

［3］李川，李婭娜，劉虎成，等.大豆蛋白改性［J］.食品工業科技，2000，21(3):75-76.

［4］田其英，華欲飛.物理方法對大豆分離蛋白功能性質影響［J］.糧食與油脂，2006(3):10-12.

［5］張龍，史吉平，杜風光，等.小麥面筋蛋白化學改性研究進展［J］.糧食加工，2006，31(6):56-58.

［6］朱建華，楊曉泉，鄒文中，等.超聲處理對大豆分離蛋白功能特性的影響［J］.食品工業科技，2004，25(4):81-83.

［7］孫冰玉，石彥國.超聲波對醇法大豆濃縮蛋白乳化性的影響［J］.中國糧油學報，2006，21(4):60-63.

［8］趙國華，王光慈，陳宗道，等.改性對玉米蛋白質功能性質和結構的影響(II)酰化［J］.中國糧油學報，2000，15(4): 14-17.

［9］Lawal O S，Adebowale K O.Effect of acetylation and succinylation on solubility profile，water absorption capacity，oil absorption capacity and emulsifying properties of mucuna bean (Mucuna pruriens)protein concentrate［J］.Nahrung/Food，2004，48(2):129-136.

［10］Mohamed A，Biresaw G，Xu J Y，et al.Oats protein isolate: Thermal，rheological，surface and functional properties［J］.Food Research International，2009，42(1):107-114.

［11］MirmoghtadaieL，KadivarM，ShahediM.Effectsof succinylation and deamidation on functional properties of oat protein isolate［J］.Food Chemistry，2009，114(1):127-131.

［12］Chavan U D，McKenzie D B，Shaidi F.Functional properties of protein isolates from beach pea(Lathyrus maritimus L.)［J］. Food Chemistry，2001，74(2):177-187.

［13］張紅印，朱加進.小麥面筋蛋白琥珀酰化改性研究［J］.中國農業科學，2003，36(3):313-317.

［14］姜紹通，唐文婷，潘麗軍.小麥面筋蛋白琥珀酰化修飾研究［J］.食品科學，2005，26(12):40-44.

Improving the emulsibility of soybean protein isolate by ultrasonic and succinylation modification

LI Lei1，CHI Yu-jie1，2，*，WANG Xi-bo1，YU Bin1
(1.College of Food Science，Northeast Agricultural University，Harbin 150030，China; 2.Administration of Education Key Laboratory of Soybean Biology，Harbin 150030，China)

In order to improve the emulsibility of soybean protein isolate(SPI)，ultrasonic processing and succinylation were used to modify the proteins.The effects of substrate concentration，ultrasonic power，ultrasonic time，the ratio of succinic anhydride，and the temperature of acylation reaction on the emulsifying activity and emulsion stability were studied by single factor experiments.Through the response surface methodology，the optimal conditions were as follows:ultrasonic power 569.36W，ultrasonic time 9.79min，and reaction temperature 49.72℃.Comparing to those of raw SPI，the emulsifying activity and emulsion stability of the proteins prepared under the optimal conditions had improved 3.05 times and 4.65 times，respectively.

SPI;ultrasonic processing;succinylation;emulsibility;response surface methodology

TS201.2+1

A

1002-0306(2011)03-0123-05

大豆分離蛋白(SPI)因其營養價值高，并且具有乳化性、溶解性、吸水性、吸油性等功能性質，而被作為一種重要的功能性輔料廣泛應用于食品加工中［1］。其中乳化性是SPI一種重要的功能性質，添加到食品中可以起到改善口感、穩定體系的乳化狀態等作用［2］。然而，天然SPI的乳化性尚不能滿足現代食品加工中的需要，因此需要對其進行改性。蛋白質改性方法主要有物理改性、化學改性、酶法改性。其中，酶法改性所用的酶制劑價格昂貴，限制了其在工業生產中的應用［3］;物理改性和化學改性由于成本低、設備要求不高等優點而成為蛋白質改性的主要手段［4-5］。其中，超聲波處理和酰化反應是蛋白非酶改性中常用的方法，兩種方法對不同蛋白乳化性的改善效果已經得到大量驗證［6-11］。然而，采用這兩種改性方法共同作用于SPI以提高乳化性的研究尚鮮見報道。本研究采用超聲波處理和琥珀酰化兩種方法對SPI進行復合改性，研究不同底物濃度、超聲時間、超聲功率、琥珀酸酐添加量和反應溫度對SPI乳化性的影響，并應用響應面方法對反應條件進行優化，建立乳化性與各因素間的數學模型，以利于實現工藝過程的控制并滿足食品加工對高乳化性SPI的需求。

2010-01-27 *通訊聯系人

李磊(1983-)，男，碩士，研究方向:農產品加工。

教育部博士點基金(20070224001);黑龍江省自然科學重點基金項目(ZD200902)。