雷氏珍菊降壓片的HPLC指紋圖譜研究△

徐曉英，唐宇偉，黃德杰，張國明

（上海市中藥研究所，上海 201401）

雷氏珍菊降壓片的HPLC指紋圖譜研究△

徐曉英，唐宇偉，黃德杰，張國明*

（上海市中藥研究所，上海 201401）

目的：探索建立雷氏珍菊降壓片的指紋圖譜質(zhì)量控制方法。方法：采用RP-HPLC梯度洗脫法測定珍菊降壓片的指紋圖譜，并運(yùn)用國家藥典委員會(huì)發(fā)布的《中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)》軟件分析比較其相似度。結(jié)果：初步建立了含有10個(gè)特征峰的雷氏珍菊降壓片高效液相指紋圖譜，并歸屬了其中的鹽酸可樂定、氫氯噻嗪、蘆丁和蒙花苷峰；14批樣品相似度系數(shù)均大于0.989。結(jié)論：RP-HPLC（DAD）法指紋圖譜特征性較強(qiáng)、重復(fù)性好，可用于珍菊降壓片的質(zhì)量控制。

雷氏珍菊降壓片；指紋圖譜；RP-HPLC

雷氏珍菊降壓片是一種中西藥復(fù)方制劑，為中老年人常用降血壓藥物之一。該制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)收載于衛(wèi)生部部頒標(biāo)準(zhǔn)[1]，由野菊花、鹽酸可樂定、氫氯噻嗪、蘆丁、珍珠層粉等成分組成。標(biāo)準(zhǔn)中只有珍珠層粉和蘆丁的定性鑒別，無含量測定項(xiàng)，難以客觀、全面、有效地控制其質(zhì)量。近年來有不少文獻(xiàn)報(bào)道采用高效液相法測定珍菊降壓片中的蒙花苷[2]、綠原酸[3]、氫氯噻 嗪和蘆 丁[4]、鹽 酸 可樂定[5-6]的含量，但未見相關(guān)的指紋圖譜研究報(bào)道。為更好地控制珍菊降壓片的產(chǎn)品質(zhì)量，本文探索了以HPLC指紋圖譜技術(shù)為手段的質(zhì)量控制方法，以期更有效控制該產(chǎn)品的一致性、重現(xiàn)性。

1 材料

1.1 儀器

Agilent1100高效液相色譜儀，G1354A HPLC四元泵，Agilent DAD-G1315A紫外檢測器，Agilent-UP-G1316柱溫箱，Agilent G1312A真空在線脫氣機(jī)，HPCHEM-STATION色譜工作站。《中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)2004A、B版》。

1.2 試藥

蒙花苷（111528-200303）、鹽酸可樂定（111528-200303）、氫氯噻嗪 （10309-001）、蘆丁 （0080-9705），均購自中國藥品生物制品檢定所。乙腈為色譜純，水為超純水（實(shí)驗(yàn)室自制），其他試劑為分析純。

野菊花浸膏樣品、雷氏珍菊降壓片由上海雷允上藥業(yè)有限公司提供。

浸 膏 批 號 （3 批）：20040107，20040503，20040701，擬用于建立浸膏對照指紋圖譜樣品；成品樣品（8批）：20010204，20011105h，20020212h，20030510， 20040121， 20040318， 20040707，20040807，擬用于建立成品對照指紋圖譜樣品；成品樣品（12批）：20020123，20020127，20020129，20020213， 2002120860， 20040101， 20040104，20040120， 20040123， 20040202， 20040227，20040303，20040326，20040713，擬用于與對照圖譜作比較的被測樣品。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent ZORBAX SB C18柱；流動(dòng)相：乙腈（A）和0.03 mol·L－1磷酸二氫鉀溶液（B）梯度洗脫，梯度條件見表1；檢測波長：210 nm；柱溫：35℃；流速：1.0 mL·min－1；進(jìn)樣量：10μL；分析時(shí)間：60 min。

表1 流動(dòng)相梯度條件

2.2 對照品溶液的制備

精密稱取蒙花苷、鹽酸可樂定、氫氯噻嗪、蘆丁對照品適量，配制成混合對照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備

取珍菊降壓片10片，剝?nèi)グ拢屑?xì)混勻，取本品粉末0.25 g，精密稱定，置100 mL具塞三角燒瓶內(nèi)，準(zhǔn)確加入50 mL 10%甲醇，稱定重量，置超聲波發(fā)生器中超聲處理30 min，放冷，再稱定重量，用10%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，濾液用0.45μm微孔濾膜濾過，棄去初濾液，取續(xù)濾液，即得。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn) 以上述色譜條件下的混合對照品溶液進(jìn)樣試驗(yàn)，鹽酸可樂定、氫氯噻嗪、蘆丁和蒙花苷的色譜峰理論板數(shù)均大于1 500；鹽酸可樂定和氫氯噻嗪二峰間分離度1.4，氫氯噻嗪和蘆丁、蘆丁和蒙花苷二峰間分離度均遠(yuǎn)大于1.5。

2.4.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取樣品（批號20040120），按2.3項(xiàng)方法處理，于0，2，4，6，8，12，24 h進(jìn)樣進(jìn)行HPLC分析。結(jié)果所測的蒙花苷、鹽酸可樂定、氫氯噻嗪和蘆丁成分保留時(shí)間和保留峰面積RSD（%）分別是0.58和1.65、0.89和1.85、0.87和1.81、0.89和1.63，均小于2.0%。

2.4.3 精密度試驗(yàn) 精密稱取樣品（批號20040120），按2.3項(xiàng)方法處理，連續(xù)進(jìn)樣5次，以蒙花苷、鹽酸可樂定、氫氯噻嗪和蘆丁成分為指標(biāo)，進(jìn)行HPLC分析，結(jié)果所測4個(gè)峰保留時(shí)間和峰面積RSD（%）分別是0.76和1.14、1.08和1.35、0.95和1.61、0.69和1.73，均小于2.0%。

2.4.4 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取樣品（批號20040707）5份，分別按2.3項(xiàng)方法處理，分別進(jìn)樣分析，結(jié)果所測的蒙花苷、鹽酸可樂定、氫氯噻嗪和蘆丁成分保留時(shí)間和峰面積RSD（%）分別是0.87和1.08、1.39和1.81、1.27和1.74、1.32和1.67，均小于2.0%。

2.5 指紋圖譜的測定及結(jié)果

分別取各批次珍菊降壓片，按2.3項(xiàng)方法處理獲得供試品溶液，進(jìn)樣10μL，記錄HPLC色譜圖，結(jié)果見圖1，主要有10個(gè)峰，其中4號峰為鹽酸可樂定，5號峰為氫氯噻嗪，6號峰為蘆丁，10號峰為蒙花苷，其余6個(gè)成分主要來自于野菊花。對照用樣品（8批）共有峰相對保留時(shí)間和相對峰面積見表2和表3。待檢驗(yàn)比較樣品（14批）共有峰相對保留時(shí)間和相對峰面積見表4和表5。

圖1 珍菊降壓片指紋圖譜（批號20040120）

表2 對照用（8批）珍菊降壓片相對保留時(shí)間

2.6 相似度分析

進(jìn)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)-A》，導(dǎo)入8批對照指紋圖譜樣品的AIA文件，以各峰作多點(diǎn)校正，生成對照指紋圖譜，結(jié)果見表6。結(jié)果顯示，8批間內(nèi)的相似度均在0.985以上，說明該藥在較長時(shí)間跨度內(nèi)，其重現(xiàn)性較佳。圖2為欲生成對照譜圖的成品樣品（8批）指紋譜圖比較，圖中R表示對照譜圖。

表3 對照用（8批）珍菊降壓片相對峰面積

表4 待檢驗(yàn)（14批）樣品相對保留時(shí)間

表5 待檢驗(yàn)（14批）樣品相對峰面積

表6 對照樣品（8批）指紋圖譜相似度分析結(jié)果

圖2 欲生成對照譜圖的成品樣品（8批）的指紋譜圖

2.7 珍菊降壓片指紋圖譜檢驗(yàn)

進(jìn)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)-B版》，先導(dǎo)入上述已生成的珍菊降壓片對照圖譜文件，再導(dǎo)入14批待檢驗(yàn)樣品的AIA文件，選定10個(gè)共有峰進(jìn)行譜峰匹配，進(jìn)行相似度比較，結(jié)果相似度評價(jià)數(shù)據(jù)均高于0.989，表明該產(chǎn)品一致性程度較高。

3 討論

本文以HPLC圖譜的出峰靈敏度和分離完整性為標(biāo)準(zhǔn)，對樣品提取用溶媒進(jìn)行了篩選，結(jié)果以10%甲醇溶液提取，效果較好。在提取方法上，對超聲提取與回流提取方法作了平行比較，結(jié)果顯示10%甲醇超聲30 min的提取方法與加熱回流3 h的效果相當(dāng)，最后選用10%甲醇超聲30 min的提取方法。

在流動(dòng)相選擇上，篩選了乙腈與多種濃度磷酸、醋酸、檸檬酸以及磷酸二氫鈉、鉀等溶液組合，結(jié)果以乙腈-0.03 mol·L－1磷酸二氫鉀溶液組合的梯度洗脫效果最佳。

珍菊降壓片是中西復(fù)方制劑，在檢測波長選擇方面，需要關(guān)注主要有效成分（鹽酸可樂定、蘆丁、氫氯噻嗪、蒙花苷λmax分別為198.40，205.40，226.00，206.80 nm），但也要兼顧其他各成分甚至包括未知的峰，為此經(jīng)篩選試驗(yàn)，確定檢測波長210 nm比較適合。

在共有峰認(rèn)定上，通過對不同期的多批供試品指紋圖譜分析，選擇了10個(gè)穩(wěn)定性好、特征明顯的色譜峰為共有峰，并歸屬了其中的4（鹽酸可樂定）、5（氫氯噻嗪）、6（蘆丁）和10（蒙花苷）號峰，其余6個(gè)峰來自野菊花或蘆丁提取物。

本文以多批具有代表性的大生產(chǎn)樣品為基礎(chǔ)，采用國家藥典委員會(huì)出版的《中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)》軟件，建立了珍菊降壓片的數(shù)字化對照指紋圖譜，同時(shí)以此為對照，檢驗(yàn)了14批雷氏珍菊降壓片樣品相似度情況，結(jié)果相似度系數(shù)大于0.989；另外其各批指紋圖譜間的保留時(shí)間和峰面積的相對誤差也分別小于3.01%和4.19%。

上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，高效液相指紋圖譜技術(shù)評判雷氏珍菊降壓片的相似性具有比較強(qiáng)的客觀性，重現(xiàn)性良好，可以作為企業(yè)內(nèi)部質(zhì)量控制或原法定標(biāo)準(zhǔn)的提高之參考。

[1]衛(wèi)生部.中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)·中藥成方制劑[S].第20冊.1998：232.

[2]張國明，華菊根，鄧海林.一種珍菊降壓片的質(zhì)量控制方法：中國，ZL200410016223.3[P].2005-08-17.

[3]郁健，葉曉鐳.HPLC法測定珍菊降壓片中綠原酸的含量[J].南京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2004，20（4）：237.

[4]閏花麗，吉曙光，黃安軍.HPLC測定珍菊降壓片中氫氯噻嗪和蘆丁的含量[J].中成藥，2004，26（7）：547.

[5]郁健，葉曉鐳.高效液相色譜法測定珍菊降壓片中鹽酸可樂定的含量[J].中國藥物與臨床，2004，4（9）：715.

[6]楊繼斌，湯曉樞.HPLC法測定珍菊降壓片中鹽酸可樂定的含量[J].藥物分析雜志，2006，26（12）：1854.

Establishment of the Fingerprint of Leishi Brand Zhenju Jiangya Tablet by HPLC

XU Xiao-ying，TANG Yu-wei，HUANG De-jie，ZHANG Guo-ming
（Shanghai Institute of traditional Chinese Medicine，Shanghai201401，China）

Objective：To establish the fingerprint of Leishi Brand Zhenju Jiangya Tablet.Methods：A fingerprinting of Leishi Brand Zhenju Jiangya Tabletwas invested by RP-HPLC with a gradient elution mode.，the simalarity was analysed by Fingerprint Similarity Evaluation Software.Results：The fingerprintingwith 10 characteristic peaks，among ofwhich peak 4，5，6 and 10 identified as Clonidine hydrochloride，Hydrochlorothiazide，Rutin and Linarin.The similarity of 14 samples are all higher than 0.989.Conclusion：The fingerprintmethod established show to be easy，repeatable and sensitive to distinguish the samples tested.

Leishi Brand Zhenju Jiangya Tablet；Fingerprinting；HPLC

上海市技術(shù)創(chuàng)新體系建設(shè)項(xiàng)目[上海市經(jīng)委2004（滬創(chuàng)新J-7）]

*張國明，Tel：（021）37565589，E-mail：zhangguoming1271＠yahoo.com.cn

2011-06-20）