基因敲除豬終獲成功加速異種器官移植

文/高妍 張琳

基因敲除豬終獲成功加速異種器官移植

文/高妍 張琳

潘登科，中國農業科學院北京畜牧獸醫研究所副研究員、博士，主要從事豬體細胞克隆、轉基因及胚胎干細胞研究，在轉基因體細胞克隆豬和體細胞基因敲除豬等研究方面取得了一批國內外領先成果。2010年獲得我國首例敲除α1，3半乳糖苷轉移酶（α1，3GT）基因的器官移植豬7頭，為創建抗超急性免疫排斥反應的器官移植豬邁出了關鍵的一步。2010年獲得敲除肌肉生長抑制素MSTN基因的雙肌豬31頭，建立了高效的體細胞基因敲除克隆豬技術平臺，為研究該基因的功能奠定了基礎。獲2008年“神農中華農業科技獎”一等獎（體細胞克隆豬和轉基因體細胞克隆豬技術平臺的建立與應用，排名第6）、2010年國家科技進步二等獎（牛和豬體細胞克隆研究及應用，排名第9）。

隨著人體器官移植技術的日趨成熟，器官供體短缺成為阻礙人們追求健康的最大因素。如何解決器官供體不足的難題，已經成為全社會普遍關注的問題。

2010年11月，中國農業科學院北京畜牧獸醫研究所成功研制出的4頭敲除α1，3半乳糖苷轉移酶（α1，3GT）單等位基因的近交系五指山小型豬，為我國創建抗超急性排斥反應的器官移植豬邁出了關鍵的一步，有助于加速我國異種器官移植研究。該項目負責人潘登科副研究員介紹：“這是我國第一例敲除超急性免疫排斥基因的異種器官移植豬，已經通過中國農業大學農業生物技術國家重點實驗室的分子鑒定。它的成功研制，使我國成為世界上少數幾個獲得成功的國家之一。”

攻堅克難 服務于人

“所謂克隆，就是一種無性繁殖，簡單說就是借助卵子將一個體細胞變成一個胚胎，經過卵子重新程序化，最終生產出個體。”潘登科介紹，不同動物有不同的生理特征，在胚胎構建、胚胎培養和移植等方面都有差異，因此不同動物的克隆技術也存在很大的區別。與牛羊相比，克隆豬的卵子成熟質量更差，體外操作更難把握，成功難度也更大。

克隆豬研究最大的應用是異種器官移植，除了可作為眾所周知的器官水平上的重要臟器的移植供體，還能夠實施細胞的移植，比如已有猴子實驗證明的胰島細胞移植可治療糖尿病。此外，克隆豬研究還是轉基因疾病模型的建立和轉基因豬育種等研究工作的基礎。

潘登科介紹，這次實驗使用的近交系五指山小型豬是我國自主培育的，它在解剖、生理結構、代謝機制、器官發育等多方面與人更為相近，是人類異種器官移植的理想供體。而近交系豬具有基因高度純合、遺傳性狀穩定、表型均一和遺傳背景清楚等優點，有助于推動異種器官移植臨床前實驗研究。目前國內有不少實驗室在克隆豬領域開展工作，現在已有七八個實驗室能做出克隆豬，但能做出基因敲除豬的只有三個實驗室。

做基因敲除豬最大的難題就是如何做好體細胞基因打靶。“體細胞基因打靶的效率非常低，只有百萬分之一甚至千萬分之一。”潘登科在提到細胞篩選工作時說，“篩選半年拿到了2000個克隆點，但鑒定后才發現只有幾個是陽性的，這個工作量是很大的。”為解決這一難題，潘登科團隊在核移植胚胎干細胞（ntES細胞）的分離和培養方面開始了探索，利用ES細胞進行基因打靶可大大提高轉基因的效率，進而提高生產轉基因豬的效率。

豬器官移植給人要解決的關鍵技術是超急性免疫排斥反應，而豬體內的α1，3半乳糖苷轉移酶基因所產生的α1，3半乳糖表位是引起超急性免疫排斥的主要因素，潘登科團隊采用體細胞基因敲除和克隆技術，敲除α1，3半乳糖苷轉移酶基因，為最終獲得抗超急性免疫排斥的體細胞克隆豬奠定了基礎。

下一步，他們的目標是用至多兩年的時間，解決其他排斥反應，同時也會做一些臨床前的研究工作。所謂臨床前研究，就是先將器官移植到與人很接近的猴子身上進行研究實驗，解決排斥反應、臨床疾病等各種可能存在的問題，最終為人的臨床應用奠定基礎。但潘登科說，要真正用到人的身上，還不能著急，要做實，將風險降到最低，更好地服務于人。

兩次成果 轟動全國

2005年7月，潘登科博士畢業來到現在的單位—中國農業科學院北京畜牧獸醫研究所基因與細胞工程室，進行豬轉基因克隆和胚胎干細胞研究。幾年間，他取得了諸多的成績：他對豬體細胞核移植技術體系進行了進一步的優化，在卵母細胞體外成熟液中添加促減數分裂甾醇（MAS），提高了卵母細胞成熟的質量；在胚胎重新程序化上，他利用TSA（去乙酰化抑制劑）處理早期胚胎，提高了克隆胚胎的囊胚發育率；在核移植供體細胞類型方面，他探索利用五指山小型豬胎兒成纖維細胞、新生豬骨髓間充質細胞和成年豬前脂肪細胞三種類型的體細胞為核供體，生產體細胞克隆胚胎和轉綠色熒光蛋白基因的體細胞克隆胚胎。

在基因敲除豬成功之前，潘登科和他的團隊已經兩次轟動中國克隆界。

潘登科參加2008年第五屆亞洲繁殖大會，并主持專題報告、作大會報告。

潘登科團隊

第一次是2005年，當時的潘登科還在農業生物技術國家重點實驗室進行博士課題研究。在導師吳常信院士和李寧院士的指導下，潘登科和當時的同學張運海博士共同合作，成功獲得了我國首例體細胞克隆豬，首次在國內報道了利用體細胞核移植技術生產豬轉基因囊胚；首次在國際上報道了不同氧分壓環境下成熟培養的豬卵母細胞支持克隆胚胎早期發育的能力相似；在世界上首次嘗試利用4℃冷藏的豬胎兒成纖維細胞為供體開展轉基因克隆胚胎生產。

另一次是2008年北京奧運會期間，由中國農業科學院北京畜牧獸醫研究所、軍事醫學科學院生物工程研究所和河北省玉田種豬場（玉田縣牧富種豬繁育有限公司）共同合作，培育出我國首批轉“ω-3”脂肪酸去飽和酶基因的克隆豬，脂肪酸檢測發現肌肉中ω-3多不飽和脂肪酸提高了13倍多。這種轉基因豬體內富含的ω-3多不飽和脂肪酸，是深海魚油的主要成分，能夠維持體內脂肪酸平衡，調節血脂，降低血膽固醇，預防冠心病、高血壓、腦中風等心腦血管疾病。這項研究的成功，是我國轉基因克隆豬制備上取得的重要進展，為轉基因豬新品種培育奠定了重要基礎，使我國成為繼美國之后第一個培育出富含“魚油”轉基因克隆豬的國家。

基因敲除豬項目是潘登科團隊2009年開始研究的，靠自身一步步摸索，在不斷的失敗中慢慢摸索，最終取得成功。這項研究也得到了軍事醫學科學院生物工程研究所陳紅星研究員、南方醫科大學基因工程研究所、甘肅農業大學動物科技學院、北京市畜牧獸醫總站和北京安定種豬場等的協助。

精誠協作 風雨向前

潘登科自小喜歡安靜，喜歡做研究，做事喜歡較真。不管是碩士期間的技術啟蒙人、中國科學院動物研究所首席科學家陳大元研究員，還是給自己奠定做大做強基礎的博士導師李寧院士，抑或是曾經的師兄師姐、現在的研究團隊，潘登科都心存感激。潘登科說，自己從他們身上學到了很多優秀的品質，懂得了什么是做科研、什么是團隊協作、什么叫榜樣的力量……

潘登科說自己能取得今天的成績，離不開同行的幫助和團隊的努力。“我們有克隆技術的保障，有軍事醫學科學院生物工程研究所陳紅星研究員在基因工程方面的豐富經驗，我們是在多方堅實基礎之上進行的綜合研究。怎樣構建好一個打靶的載體，如何做好細胞篩選……”潘登科團隊通過無數次的實驗解決細胞不純、細胞老化等問題，一點點向前推進，逐漸摸索出了自己的研究思路和研究方法，最終取得成果，并達到國際先進水平。

“誰都想為社會做出漂亮的工作，在基因敲除豬這方面，我們覺得很有自信！”潘登科提到自己和團隊的研究工作時不無自豪地說，“剛開始的時候，大家都覺得是天方夜譚，可我們經過努力做出來了。目前在世界上我們的技術也是非常棒的，而且我們做的工作很有分量，是貼合國際發展潮流、滿足國家戰略發展需要的。”

現在潘登科的動物克隆和轉基因研究組共有7個研究人員，個個都是有著過硬技術的好手，精誠協作的精神使具有不同專長的他們，能夠在研究的過程中獲得最大化的效能。他們始終本著對科研高度負責的態度，以高效生產具有重要研究和應用價值的轉基因動物為自己的最終目標。

2010年，潘登科團隊又獲得了敲除肌肉生長抑制素MSTN基因豬31頭，為研究該基因的功能奠定了基礎。

潘登科介紹，現在和未來的一段時間，實驗室將充分利用自身優勢—克隆技術平臺、轉基因技術平臺和細胞篩選平臺，并調配精力到轉基因豬遺傳分析和功能鑒定方面。“拿到轉基因豬以后，我們需要對基因的功能、表型等從分子水平、蛋白水平等做一系列的鑒定，確定轉基因豬的應用價值。”接下來，他們還打算將現在比較強調克隆和轉基因技術研究的實驗室，打造成更加全面、具備更系統研究功能和評價體系的平臺。

現在，敲除α1，3半乳糖苷轉移酶基因的體細胞克隆豬和敲除肌肉生長抑制素MSTN基因豬即將進入擴繁和功能評價研究。任重道遠，未來等待潘登科及其研究團隊完成的任務還很多。

富含ω-3多不飽和脂肪酸的克隆豬

敲除α1，3GT單等位基因的近交系五指山小型豬