豬傳染性胃腸炎病毒Sa 基因的克隆與序列分析

溫海燕 （菏澤學院動物科學系 山東 菏澤 274015）

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豬傳染性胃腸炎病毒Sa 基因的克隆與序列分析

溫海燕 （菏澤學院動物科學系 山東 菏澤 274015）

將豬傳染性胃腸炎病毒接種ST細胞進行增殖，待細胞出現明顯的病變后，將細胞反復凍融3次收獲病毒。根據GenBank中已發表的豬傳染性胃腸炎病毒S基因的序列，設計合成了1對擴增S基因包含A抗原位點724bp基因片段(Sa)的引物，引物兩端分別有HⅠ和dⅢ的酶切位點。以感染細胞提取的病毒RNA為模板，經RT-PCR擴增得到目的片段，然后將其克隆到pMD18-T載體上，經藍白斑篩選和酶切鑒定選擇陽性克隆進行序列測定，構建成功的重組質粒命名為pMD18-T-Sa。用DNAstar軟件將其與GenBank上的序列進行同源性比較，結果表明，核苷酸同源性為97%以上，氨基酸同源性為93%以上。根據豬傳染性胃腸炎病毒Sa基因核苷酸序列繪制的系統進化樹，結果表明，試驗株與TH-98株親緣性最近。

胃腸炎病毒 Sa基因 克隆 序列分析

豬傳染性胃腸炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus of swine,TGEV)隸屬于冠狀病毒科冠狀病毒屬，是引起仔豬病毒性腹瀉的重要病原，由其引起的豬傳染性胃腸炎(Transmissible gastroenteritis of swine,TGE)是一種急性、高度接觸性腸道傳染病，是世界動物衛生組織(OIE)法典中B類疫病中必檢的豬傳染病。不同年齡和品種的豬均易感，尤其以仔豬最易感，2周齡以內的仔豬致死率高達100%，以嘔吐、腹瀉、脫水、高死亡率為典型癥狀，成年豬死亡率較低，但是會造成機體消瘦，降低飼料利用率等[1]。目前該病已遍布全世界各國，給養豬業造成了巨大的經濟損失。

TGEV由4種結構蛋白和3種非結構蛋白構成，其中S蛋白為大的糖蛋白，形成病毒突起，攜帶主要的B淋巴細胞抗原決定簇，是唯一能誘導機體產生中和抗體和提供免疫保護作用的結構蛋白；含有宿主細胞氨肽酶受體(PAPN)的識別位點，在決定宿主細胞親嗜性方面起關鍵作用[2]。S基因長度為4.35×103bp，包括A、B、C、D4個位點，其中A位點又可分為Aa、Ab、Ac 3種亞位點，A位點暴露于病毒的表面，主要誘導中和抗體的產生，并且不同分離株的A位點保守性強[3,4]。

目前國際上已培育多種弱毒疫苗，有德國的BI-30疫苗株，匈牙利的CKP弱毒株，美國的TGE-Vac株等等，國內哈爾濱獸醫研究所也培育成功華株弱毒疫苗[5]。弱毒株大多是經不同方式的人工致弱而成，一般的弱毒疫苗均有一定的殘余毒力與致病性，在動物體內增殖誘發免疫力的同時又有毒力返強的可能。而滅活疫苗接種后雖能誘導機體產生比弱毒疫苗更高的循環抗體，但因機體缺乏局部的黏膜免疫，不能有效地抵抗外界野毒的侵襲[6]。鑒于此，本研究對豬傳染性胃腸炎病毒Sa基因進行克隆與序列分析，為豬傳染性胃腸炎病毒新型基因工程疫苗的研制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料 1640培養基(購自美國HyClone公司)，新生牛血清購自上海華美公司、Taq DNA聚合酶、TAKARADNA Fragment Purification Kit 、DNA 分子量標準 DL2000、限制性內切酶HⅠ和dⅢ、T4DNA 連接酶、膠回收純化試劑盒購自大連寶生物工程有限公司，X-gal、IPTG購自Merk 公司、DEPC購自Sigma公司、胰蛋白胨和酵母提取物購自OXOID公司，ST細胞、DH5α、豬傳染性胃腸炎病毒均有傳染病實驗室保存，pMD18-T Vector購自大連寶生物工程有限公司。

1.2 引物的設計與合成 根據GenBank中已發表的基因序列，應用Primer5.0軟件自行設計合成了一對能擴增724bp基因片段(包括S基因A抗原位點)的引物，兩端分別含有HⅠ和dⅢ的酶切位點及保護性堿基，序列：P1：5’ACGTCA TTG AAC ACA ACG GGT GGT GTC 3’HⅠ；P2：5’ AGCCTG TGG CAT CTA AAA CGT CCG T3’dⅢ。送北京賽百盛基因技術有限公司合成。

1.3 病毒RNA的抽提 將病毒液接種到ST單層細胞上，72h后，待細胞出現明顯的細胞病變，將細胞反復凍融三次。10000rpm離心10min，取上清，獲得的病毒液參照Trizol(一步法總RNA提取試劑)試劑盒說明書進行操作。

1.4 RT-PCR （1）cDNA的合成參照M-MLV Reverse Transcriptase 說明按下列體系進行反轉錄：RNA模板1μl，0.5μl下游引物P2，9μl RNase Free H2O，70℃溫浴5min結束后立即放在冰上。繼續添加4μl 5×M-MLV RTase buffer，2μl 100Mmdtt，2μl dNTP(2.5mM)，0.5μl RNase inhibitor，1μl M-MLV RTase，37-42℃溫浴1h，得到的反應液可立刻用于PCR反應或－20℃保存備用。（2）Sa基因的PCR擴增。按常規方法進行PCR反應，冰上操作，采用25μl體系，PCR 管中依次加入以下試劑：3μl cDNA模板，2.5μ1 0×PCR Buffer，0.5μl上游引物P1(20pmoL/μl)，0.25μl Taq DNA聚合酶(5U/μl)，18.75μl ddH2O，優化后的PCR反應條件：94℃ 5min，94℃ 1min、69.4℃ 1min、72℃ 1min進行30個循環，72℃10min。PCR結束后，PCR產物用1%瓊脂糖凝膠進行電泳，觀察結果。

1.5 目的片段的回收、純化及序列測定 參照超薄瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒說明回收純化目的片段，然后將其與pMD18-T載體連接，將連接產物轉化感受態細胞DH5α，挑斑，擴大培養，抽提重組質粒進行酶切鑒定和PCR鑒定，將鑒定為陽性克隆的菌液送寶生物(大連)有限公司測序。

1.6基因序列分析 利用DNAstar 軟件對所測定的基因的核苷酸序列及推導的氨基酸序列進行編輯，并與GenBank中的序列進行同源性比較，然后用ProtScale軟件對編碼的Sa蛋白的空間進行模擬分析。

2 結果與分析

2.1 TGEV Sa基因的RT-PCR擴增 以TGEV RNA為模板，應用引物P2，反轉錄合成第一鏈cDNA，以P1和P2為引物擴增Sa基因，所獲得的PCR產物在1.0%瓊脂糖凝膠電泳上呈單一條帶，大小與預期724bp相符(圖1)。

2.2 質粒的雙酶切鑒定 重組質粒經HⅠ和dⅢ雙酶切后，得到約760bp的插入片段和約2656bp的載體片帶，證明所挑取的克隆為正確的重組轉化子，將得到的重組質粒命名為pMD18-T-Sa(圖2)。

2.3 重組質粒的PCR鑒定 將重組質粒pMD18-T-Sa轉化入大腸桿菌DH5α感受態細胞，獲得大量轉化子。從中隨機挑選幾個重組子單菌落，用PCR方法進行鑒定，瓊脂糖凝膠電泳結果顯示，以引物P1和P2擴增出了大小為724bp的特異片段，表明所檢測的克隆中均含有外源目的片段的插入(圖3)。

圖1 RT-PCR擴增結果

M：DNA標準DL2000；1-2：RT-PCR擴增產物

圖2 重組質粒pMD18-T-Sa雙酶切鑒定結果

M：DNA標準DL2000；1-2：雙酶切鑒定結果

圖3 重組質粒pMD18-T-Sa PCR鑒定

M：DNA標準DL2000；1-2：重組質粒pMD18-T-Sa PCR 鑒定

2.4 Sa基因的序列測定及分析 將疑似陽性克隆的菌液送寶生物(大連)公司進行測序，用DNAstar軟件將測定序列與GenBank中的序列進行同源性比較，結果表明：試驗株Sa基因與GenBank中毒株TH-98、HN2002、SC-Y、133、TS的基因核苷酸同源性分別為99.3%、97.9%、99.6%、97.7%、97.9%，氨基酸同源性分別為97.9%、95.0%、98.8%、93.8%、95.0% (表1)，再根據它們的核苷酸序列繪制系統進化樹(圖4)，結果表明：試驗株與TH-98毒株在進化上親緣關系最近，最后利用DNAstar軟件對Sa片斷的抗原表位進行分析，由圖可見第178-231(即S基因A位點)位點抗原性好(圖5)。

表1 不同病毒株Sa基因的核苷酸及氨基酸同源性比較(%)

注：*表示同源性為100%

3 討論

（1）豬傳染性胃腸炎病毒感染具有明顯的腸嗜性，病毒粒子表面的纖突蛋白(S蛋白)與存在于腸上皮細胞頂膜的氨基肽酶(APN)的結合是感染發生的首要條件，因此，S蛋白是免疫預防和診斷研究的重點。TGEV只有1個血清型，而變異卻使TGEV各毒株之間產生了抗原差異。彭樹英等[7]將TSX毒株S全基因序列與其他毒株相比，雖在核酸和氨基酸序列上存在一定差異，但形成4個抗原位點的核酸和氨基酸序列并未發生變異，Aa、Ab、Ac位點仍高度保守，并且A位點的缺失可導致S蛋白喪失產生中和抗體的能力。因此，本研究設計引物擴增了一段包含TGEV S基因A位點的片段，為豬傳染性胃腸炎基因工程疫苗的研制奠定了良好基礎。（2）TGEV病毒通過消化道進入仔豬體內，其靶細胞都是腸絨毛上皮細胞，引起腸絨毛的萎縮脫落，導致動物消化紊亂、酸中毒和脫水。在預防上，如果在腸腔內經常有抗體存在，就可以不斷中和豬體攝入的病毒，從而起到保護作用。因此，黏膜免疫是本病特異性免疫應答的主要特征，而腸道黏膜表面SIgA含量的高低直接決定臨床疾病的發生和疾病嚴重程度[8]。針對本病的特點，采用口服免疫是較為理想的預防途徑，口服免疫突出的優點是可有效地刺激腸道局部免疫細胞產生SIgA，尤其適應于腸道黏膜傳染病，而探索安全、有效、廉價、可以誘導黏膜免疫產生的新型疫苗顯得尤為重要。本試驗成功地克隆得到了TGEV Sa基因，結合枯草芽孢桿菌基因的功能特點，構建新的跨膜體系，為研制有效誘導黏膜免疫產生的新型疫苗奠定基礎。

圖4 根據豬傳染性胃腸炎病毒不同毒株Sa基因核苷酸序列繪制的系統進化樹

圖5 利用DNAstar軟件對TGEV Sa片斷的抗原表位分析

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（2011–02–26）

S852.65+9.4

A

1007-1733(2011)04-0001-03