生物傳感器在食源性致病菌檢測中的應用

張 捷，陳廣全，樂加昌，張惠媛，顧德周，唐茂芝，王佩榮，汪 琦，張 昕

（1.北京出入境檢驗檢疫局，北京100026；2.中國科學研究院生物物理研究所，北京100101；3.國家認監委認證認可技術研究所，北京100020）

生物傳感器在食源性致病菌檢測中的應用

張 捷1，陳廣全1，樂加昌2，張惠媛1，顧德周1，唐茂芝3，王佩榮2，汪 琦1，張 昕1

（1.北京出入境檢驗檢疫局，北京100026；2.中國科學研究院生物物理研究所，北京100101；3.國家認監委認證認可技術研究所，北京100020）

目前傳統的檢測食源性致病菌的方法主要依賴培養基對存活的細胞進行選擇分離和傳代，雖然這種方法很有效，但其檢測周期長、程序復雜等缺點已經不能滿足現代檢測的要求。隨著科學技術不斷發展，特別是免疫學、生物化學、分子生物學的不斷發展，人們已經建立了不少快速、簡便、特異、敏感、低耗的檢測技術。本文對應用生物傳感器對食源性致病菌檢測方法的發展及其前景進行了綜述。

生物傳感器，食源性致病菌，快速檢測

1 生物傳感器簡介

生物傳感器是利用生物物質作為識別元件，將生化反應轉變成可定量的物理、化學信號，從而能夠進行生命物質和化學物質檢測和監控的裝置。生物傳感器技術是發展生物技術必不可少的一種先進的檢測方法與監控方法，也是物質分子水平的快速、微量分析方法。各種生物傳感器有以下共同的結構：包括一種或數種相關生物識別元件及能把生物活性表達的信號轉換為電信號的物理或化學換能器（信號轉換器件），二者組合在一起，用現代微電子和自動化儀表技術進行生物信號的再加工，構成各種可以使用的生物傳感器分析裝置、儀器和系統。生物識別元件可能是一種組織、生物膜、微生物、有機體、細胞、酶、抗體、抗原或核酸等。信號轉換器件可能是一種或多種光學的、電化學的、熱敏的、壓電的、磁性的技術組合。生物傳感器可以根據生物識別元件以及信號轉換器件的種類進行分類。圖1顯示了生物傳感器的分類。

圖1 生物傳感器的分類

近年來，生物傳感器已經在醫學診斷、食品營養、環境監測、國防工業及人類衛生保健等諸多領域中得到了廣泛的應用。

2 生物傳感器按識別元件分類及檢測應用

生物識別元件及生物識別成分是生物傳感器的特異性的關鍵。生物識別元件是利用生物化學原理進行識別的一類生物物質。生物識別元件通常分為5個不同的種類，包括抗體/抗原、酶、核酸/DNA、細胞、仿生體和噬菌體，其中酶、抗體以及核酸被廣泛地使用。

2.1 抗體生物識別元件

抗體通常作為生物識別元件應用到生物傳感器中。抗體可以是單克隆、多克隆或是重組體，它們常被固定在檢測器的表面、附近位置或是運輸載體上[1]。抗體能夠與抗原特異性結合，這種獨特的抗體性質使免疫傳感器成為一種強大的分析工具，即使是在背景物質大量存在的情況下，也可以使用作為特異性探針的抗體去識別和匹配存在的目標分析物。共價修飾抗體在很多情況下能夠滿足特定目的檢測的需要。在食源性病原菌檢測領域，以制備抗體為傳感元件的生物傳感器近年來時有報道，如表面等離子共振（SPR）[2]、光纖生物傳感器[3]、磁共振傳感器[4]以及免疫傳感器[5]等。

2.2 酶生物識別元件

利用酶作為生物識別元件的生物傳感器有著良好的應用前景，因為它們具有專一性和高效性。選擇性酶和合適的底物結合能為工作電極提供足夠的電子轉移。在病原菌檢測領域，酶作為生物識別元件不僅具有高度的特異性，而且酶的催化活性能增強檢測食源性病原菌的能力及靈敏度。由于酶標技術的改善，酶標抗原和抗體得到了廣泛的應用。酶的優點是高靈敏性、直接可視性以及穩定性，但是它還存在如檢測步驟多、來自內源性酶的干擾等缺點。酶免疫試劑穩定、靈敏、不會對人類健康產生危害。許多酶檢測是可視的，成本低，減少了繁雜設備的使用。

有3種酶通常應用到ELISA法——堿性磷酸酶、辣根過氧化物酶（HRP）以及β-半乳糖苷酶。在過去20年里，有不少研究人員利用酶做標記的免疫系統進行食品的病原菌檢測。2005年，Chemburu利用辣根過氧化酶（HRP）標記抗體，采用高分散碳原子夾心免疫分析對食源性病原菌如李斯特菌、大腸桿菌以及空腸彎曲菌進行了檢測[6]。

2.3 核酸生物識別元件

CO分析儀系統作為燃燒控制系統的眼睛，分析儀的CO數據將通過PLC程序控制燃料系統及助燃空氣系統，其工作好壞將直接影響到燃燒自動控制系統的穩定。主要下列裝置組成：

近年來DNA生物傳感器與生物芯片技術得到了不斷的完善，在病原菌檢測中，核酸生物識別元件可以利用有機體遺傳物質的堿基配對進行識別目標分析物。由于每個機體都有自己獨特的DNA序列，任何的微生物自我復制都可以容易地檢測出來。以核酸作為生物識別元件的生物傳感器具有簡便、快速及低成本的特點，因此，在病原菌檢測上得到了廣泛的運用。與酶或者抗體生物識別元件相比，核酸生物識別元件可以快速合成及再生。DNA損傷是影響核酸生物識別的一個非常重要的因素，對有毒化學物質的檢測可能會改變DNA的結構或堿基序列而導致DNA不可逆的損傷，進而干擾DNA的復制，影響檢測結果。以核酸為基礎的生物傳感器在檢測食源性致病菌方面已有較多的研究，可以用來檢測大腸桿菌O157：H7[7]、沙門氏菌[8]以及空腸彎曲桿菌[9]等。DNA雜交微陣列技術可以在食品檢測中快速、高通量的檢測病原微生物。

2.4 噬菌體識別元件

從過去十年的研究來看，酶、抗體以及核酸等作為生物分子識別元件被使用并且各有利弊。近年來，噬菌體作為生物識別元件開始用于各種病原微生物的檢測。這些噬菌體是一些能與細菌表面特異的感受器相連的病毒，它能將核酸注入細菌的內部進而使細菌發生感染。噬菌體通過它們的尾部尖端的蛋白質識別細菌，由于識別是高度特異性的，因此它被用來進行細菌分型并開創了特定病原菌檢測技術的發展途徑。研究者們利用以噬菌體作為生物識別元件的不同傳感平臺對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌[10]、炭疽芽孢桿菌孢子[11]進行了檢測。

3 生物傳感器按信號轉換器件分類及檢測應用

信號轉換器件在生物傳感器檢測中起到非常重要的作用。生物傳感器可以根據信號轉換方式進行分類。對于食源性病原菌的檢測，在過去的10年多的研究里，盡管有一些新型的信號轉換器件不斷地被開發并應用在生物傳感器中，但是像光學式、電化學式以及質量式等流行和通用的信號轉換方式仍被廣泛使用。

3.1 以光學為基礎的生物傳感器

光學生物傳感器具有靈敏度高和選擇性強的特點，在病原菌的檢測領域得到了廣泛的應用。以光學為基礎的檢測根據吸收、反射、折射、色散、紅外、拉曼光譜、化學發光、熒光以及磷光等分為許多亞類。然而，上述所有亞類都需要一個合適的光譜儀去記錄分析物的光譜特性。最常用的光學檢測技術是表面等離子體共振和熒光技術，這是由于它們所具有的靈敏度決定的。光纖通道、激光、棱鏡以及波導等光學技術也經常運用到病原菌檢測領域。

傅里葉變換紅外光譜（FT-IR）是一種在食源性病原菌檢測領域中非常有潛力的非損毀分析技術。Yu在研究包括沙門氏菌在內的8種不同微生物的生物區分以及定量分析中進一步完善了傅里葉變換紅外光譜技術[13]。

3.1.2 表面等離子共振 表面等離子共振（SPR）是一種利用反射光譜進行病原菌檢測的常見方法。SPR能夠檢測到折光率微小的變化狀態。病原菌的直接標記檢測也可以利用此種方法。利用SPR技術的生物傳感器可以對如單增李斯特菌[14]、沙門氏菌[15]、大腸桿菌O157：H7[16]以及空腸彎曲菌[15]的食源性病原菌檢測。利用SPR技術進行監控和識別病原菌的商用光生物傳感器被廣泛用于食源性病原菌檢測領域，如SpreetaTM生物傳感器被用來檢測大腸桿菌O157：H7，BIACORE 3000用來檢測單增李斯特菌[17]和沙門氏菌[18]。Waswa對使用SpreetaTM生物傳感器進行大腸桿菌O157：H7進行了研究，他們對樣品進行實時處理并在樣品被注入30min后得到了結果，大腸桿菌O157：H7的檢測靈敏度是102～103CFU/mL。這種生物傳感器只對大腸桿菌O157：H7有特異檢出效果，對大腸桿菌K12和志賀氏菌沒有產生任何顯著的變化。一個良好的生物傳感器必須有從一個復雜的混合物中檢測出目標分析物的能力。Taylor的研究表明，多通道SPR生物傳感器可以從復雜的混合物中同時檢測出多種目標分析物[15]。

3.1.3 光導纖維 基于全內反射（TIR）原理，光導纖維可以用來傳輸光。由于光通過光纖或波導管傳輸時對環境非常敏感，利用光導纖維制作的檢測器廣泛地運用于食品病原菌的檢測等領域。在檢出限方面，光纖生物傳感器可以達到與先進的大型臺式儀器相當的效果[19]。利用此項技術對李斯特菌[20]、沙門氏菌[21]、大腸桿菌O157：H7[22]以及梭狀芽孢桿菌[23]的檢測已有報道。

光纖生物傳感器能減少存在于復雜基質食品中PCR抑制劑的影響，通過光纖生物傳感器能夠快速地從復雜基質中檢測出病原菌。Simpson和Lim提出的方法縮短了檢測的時間，對于大腸桿菌O157：H7從原來的10h減少到2h，利用光纖波導不需要進行培養和富集的步驟[24]。2002年，Ye對生物傳感器進行了進一步的研究，將化學發光反應細胞、光纖光導和光度計連接到電腦上，結合免疫磁性分離對大腸桿菌O157：H7進行快速檢測。利用這種生物傳感器可以在1.5h內檢測濃度限量為1.8×102CFU/mL的大腸桿菌O157:H7。同樣，商用光纖傳感器也已用于食源性致病菌的檢測領域中了，如便攜式自動生物傳感器RAPTOR檢測食品中的腸炎沙門氏菌[21]。

3.2 以電化學為基礎的生物傳感器

以電化學為基礎的檢測方式可以對食源性病原菌進行定性和定量的檢測。基于對觀察到的參數，如電流、電壓、阻抗以及電導傳感器被分為電流、電壓、阻抗以及電導型。科學家們已經研究了利用不同的電化學生物傳感方法對食源性病原菌進行檢測。此類檢測方法的優點在于低成本、能夠檢測污濁的樣品、檢測儀器的小型便攜化，但是與光學檢測相比其靈敏度和選擇性具有一定的限制[25]。電化學生物傳感器還可以和其他傳感技術結合以增強檢測能力。

3.2.1 安培檢測 安培傳導法是用于病原菌檢測的非常普遍的電化學檢測方法，此法比電位法具有更高的靈敏性。以安培為基礎的傳感器檢測電勢體現在分析物產生的電流上。1962年，Clark和Lyons對于在電極中產生成正比的氧濃度的氧化電極進行了研究，此類傳感器為最簡單的電流型生物傳感器的代表[26]。很多科學家利用安培檢測法對例如大腸埃希氏O157：H7[27-28]、沙門氏菌[27]、單增李斯特菌[28]以及空腸彎曲菌[28]等食源性致病菌進行了研究。

Reymond開發了當傳感器是一個綜合樣品采集系統或分析物的測量裝置時對于微流控傳感器中分析物的存在、數量以及濃度的檢測的安培檢測方法[29]。微流控傳感器中充滿了用于被測的樣品，安培法通過產生的電勢可直接或間接地去檢測分析物。不同的分析物利用產生的氧化和/或還原電勢而被檢測出來。在此方法中，綜合工作電極上電勢的產生和相關電流的檢測在2～10s之間就能完成，連續的安培檢測的弛豫時間間隔在1～60s之間。

3.2.2 電位檢測 以檢測電位為基礎的生物識別過程是一個電位信號轉換的過程。通常使用高阻抗電壓表在兩個電極接近零電流時測量電勢差或電動勢能。由于電位反應產生對數級濃度信號，因此，這種技術可以檢測到非常微小的濃度變化。目前用于病原菌檢測的電位生物傳感器種類較少，如光尋址電位傳感器（LAPS）[30]。Ercole研究了以發光二極管為基礎的生物傳感電位交替（PAS）系統檢測蔬菜食品中的大腸桿菌[31]。發光二極管作為轉換器件用于檢測由于大腸桿菌抗體共軛所產生的NH3的變化所引起的pH的變化。通過PAB體系和傳統CFU法進行液相系統分析。研究顯示，PAS系統與常規方法進行比較具有靈敏和快速的特點，在分析時間大約1.5h內能夠檢測出濃度為10cells/mL的細菌，比常用的CFU方法減少10到20倍的檢測時間。

3.2.3 阻抗檢測 最近幾年，將阻抗和生物識別技術整合在一起來檢測病原菌，引發了阻抗生物傳感器的迅速發展和廣泛應用[32]。阻抗轉換技術已應用于檢測各種食源性病原菌。電化學阻抗譜（EIS）在生物傳感器的發展中起著重要的作用。EIS是一種廣泛應用的技術，可以用來探索在導電聚合物表面的生物分析間的相互作用，通過電阻轉換來研究“無標記”分析物的檢測[33]。雖然EIS相對于安培法或電勢法來說能夠進行無標記檢測，但是它的檢出限要比傳統法還低。Yang使用叉合微電極作為阻抗傳感器用于快速檢測沙門氏菌活菌[34]。在鼠傷寒沙門氏菌的生長過程中，記錄了四個頻率（10、100Hz，l、10kHz）下阻抗對菌體生長時間的阻抗生長曲線。結果表明直至菌體細胞數量達到105～106CFU/mL，阻抗都沒有改變。利用電子掃描顯微鏡觀察附著在電極表面的細菌，發現它對電阻的測量有一定的影響。

3.2.4 電導檢測 大多數的反應涉及到離子種類、濃度的改變，從而導致了電導或電流的改變。通常，電導傳感器包括兩個分開一定距離的金屬電極，交流電通過兩個電極形成電流。在生物識別部分，離子組成的改變和金屬電極之間電導的變化被測量出來。Muhammad-Tahir和Alocilja開發了一種電導傳感器用于食源性病原菌如大腸桿菌O157：H7、沙門氏菌的檢測[35]。據報道，該方法的最低檢出限為7.9× 101CFU/mL，檢出時間在10min以內，同時該法具有特異性好、靈敏度高、容量小以及接近實時監測裝置的優點。Pal等人開發了一種直接電荷轉移電導傳感器用于食品中蠟樣芽胞桿菌的檢測[36]。該生物傳感器利用了夾層免疫分析的原理，通過導電聚苯胺與電子電荷流半自動相連，以此產生電信號，對食品樣品中菌體濃度的檢出范圍為35～88CFU/mL，檢出時間為6min。該傳感器由于具有快速、靈敏度高及易用性的特點，使得它成為一種在食品供應鏈保護上的快速檢測方法。

3.3 質量敏感生物傳感器

質量敏感生物傳感器適合于非常靈敏的檢測，它的轉換基于質量的微小改變。質量分析的主要方式取決于所利用的壓電晶體。使用在特定頻率下的電信號使晶體發生振動，振動的頻率不僅取決于對晶體施加的電頻率，而且依賴于晶體的質量。因此，當質量增加就會導致化學連接、晶體振動頻率的改變，這個改變可以通過電來測量并應用于質量增加的晶體的檢測。石英常用作普通的壓電材料，基于質量的傳感器主要有兩種類型：體波（BW）或石英晶體微天平（QCM）；表面聲波（SAW）。壓電式傳感器的表面用抗體涂布后放在一個含有病原菌的溶液中，目標物就會附著在表面涂布的抗體上，結果導致了晶體質量的增加，這帶來了一個相應的頻移。基于質量的檢測比較容易操作，符合成本效益，并提供了靈敏度和特異性都較高的直接無標記分析。但是，壓電傳感器與電化學及光學生物傳感器相比則很少用于食源性病原菌的檢測。Vaughan等人利用QCM免疫傳感器檢測單增李斯特菌的檢出限為1×107cells/mL[37]。Chen等人研究了利用表面聲波（SAW）來快速檢測鼠傷寒沙門氏菌、大腸桿菌O157：H7[38]。

4 展望

由于食源性病原菌在數百萬的細菌中只占很少的一部分（＜100CFU/g），所以很難對它們進行檢測[25]。因此在檢測過程中，這些細菌有更多的機會不被檢測出來。這就需要開發一種可靠、快速、靈敏、有選擇性以及成本可行的檢測技術。此外，它還能夠對樣品中病原菌有一個低濃度的檢出限，以及適合于實時監測。例如，利用F0F1-ATPase分子馬達連接上不同的基因探針，可以實現對不同病原菌快速、特異性、高通量的檢測。像這樣的病原菌檢測技術能為食品加工和制造業帶來具大的商業價值。通過生物傳感器快速檢測微生物病原菌，可以使被檢食品在數小時內進入市場，同時也無需傳統的冷凍儲存環節。

近年來生物傳感器技術發展迅速，隨著微加工技術和納米技術的進步，生物傳感器將不斷的微型化，各種便攜式生物傳感器的出現使在市場上直接檢測食品成為可能。生物傳感器還將與計算機緊密結合，自動采集、處理數據，實現采樣、進樣、結果的連續完成，形成檢測的自動化系統。生物傳感器技術的不斷進步，必然要求不斷降低產品成本，提高靈敏度、穩定性和壽命，這些特性的改善也會加速生物傳感器市場化、商品化的進程。

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Biosensors and its application in foodborne pathogens detection

ZHANG Jie1,CHEN Guang-quan1,YUE Jia-chang2,ZHANG Hui-yuan1,GU De-zhou1,TANG Mao-zhi3, WANG Pei-rong2,WANG Qi1,ZHANG Xin1
（1.Beijing Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau,Beijing 100026,China；2.Institute of Biophysics Chinese Academy of Sciences,Beijing 100101,China；3.China Certification and Accreditiation Institute,Beijing 100020,China）

At present the traditional methods of detection of foodborne pathogens depends on the survival of the cell culture medium selective isolation and passage，although this method is very effective，but the testing cycle is long，complicated procedures and other shortcomings can not meet the requirements of modern detection. With the continuous developments of science and technology，especially in immunology，biochemistry，molecular biology，people have established a number of rapid，simple，specific，sensitive，low cost detection technology.This article on biosensors on the detection of foodborne pathogen in the development and future were reviewed.

biosensor；foodborne pathogen；rapid detection

TS207.4

A

1002-0306（2011）10-0453-05

近年來食品安全得到了世界各國的普遍關注，但是由微生物、化學物質以及毒素污染而導致食源性疾病的暴發仍然是許多國家共同存在的問題。目前，許多微生物檢測方法都可以檢測出食品中常見的病原菌，但大多依賴于傳統的培養法，耗時耗力，完成一次檢測通常需要幾天的時間。這樣不僅增加了實驗室的工作量，而且也不利于食品工業中生產流程的監測、終產品的質量控制以及政府部門對食品安全的管理和控制。隨著生物技術的進步，在食品檢測領域也出現了許多比傳統方法更加快捷、敏感性更強的新技術。這些快速方法主要利用微生物學、化學、生理學、分子生物學、免疫學以及血清學原理對細菌進行早期診斷，并對分離物的性狀進行測定。本文對利用生物傳感技術進行食源性病原菌的檢測進行了綜述性介紹。

2011-05-09

張捷（1965-），男，博士，高級工程師，研究方向：食品檢測和食品安全評價。

國家質檢總局科技計劃項目（2011IK191）。