堿性蛋白酶酶解綠豆分離蛋白制備多肽的工藝研究

李 楊，江連洲，*，王 梅，劉 琪

（1.東北農業大學食品學院，黑龍江哈爾濱150030；2.國家大豆工程中心，黑龍江哈爾濱150030）

堿性蛋白酶酶解綠豆分離蛋白制備多肽的工藝研究

李 楊1，2，江連洲1，2，*，王 梅1，劉 琪1

（1.東北農業大學食品學院，黑龍江哈爾濱150030；2.國家大豆工程中心，黑龍江哈爾濱150030）

選用Protex-6L堿性蛋白酶對綠豆分離蛋白進行酶法水解生成多肽,以多肽肽得率為考察指標，對其酶解工藝進行研究。基于單因素實驗，考察了酶解條件：pH、酶解溫度、底物濃度、加酶量、酶解時間等對酶解的影響,利用Design Expert7.1.1軟件設計響應面對酶解條件進行優化分析。結果表明：pH9.37、酶解溫度55℃、底物質量分數7.0%、加酶量5000.02U/g條件下酶解4.76h，多肽得率可達到91.37%。

Protex-6L堿性蛋白酶，多肽得率，響應面

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

綠豆粉 60目，自制；Protex-6L堿性蛋白酶 novo公司，1.0×105U/g；其他試劑 均為分析純。

電子分析天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；LDZ5-2型臺式低速離心機 上海安亭科學儀器廠；KDN-04Ш型蛋白質測定儀，HYP-1020二十孔消化爐 上海纖檢儀器有限公司；DU800型紫外分光光度計 美國貝克曼庫爾特有限公司；電熱恒溫水浴鍋 余姚市東方電工儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 綠豆分離蛋白的提取[6]綠豆磨粉過60目，加水溶解，將稀釋液調pH至10.0，30℃下攪拌30min。充分攪拌后4000r/min離心20min，取上清液，沉淀物加水調pH至10.0，同樣方法再次離心，得到的上清液與之前的合并，調pH至4.6，離心，取沉淀進行冷凍干燥，即得綠豆分離蛋白。

1.2.2 蛋白質測定 凱氏定氮法（GB5009.5-2010）。

1.2.3 酶活力測定 福林酚法[8]。

1.2.4 TCA-NSI測定 依據三氯乙酸（TCA）可溶性氮法（NSI）法（Jang chudA，1999），多肽得率（%）計算公式為：

式中：TCA-NSI—三氯乙酸可溶性氮得率，%；N1—在10%TCA中可溶性氮，mg；N2—原料大豆中總氮，mg。

1.2.5 酶解反應工藝流程[9]以蒸餾水配制一定濃度的綠豆分離蛋白溶液，調節pH至實驗設定值，在實驗設定的溫度加入反應所需的酶，同時低速攪拌混合。反應過程中以1mol/L的NaOH溶液嚴格控制酶解液的pH，酶解一定時間后，再以等體積比加入三氯乙酸（TCA，10%）并放置于60℃水浴中加熱10min，將未反應完全的蛋白質沉淀，用10000r/min的轉速離心15min，取上清，測體積，然后定氮。

1.2.6 堿性蛋白酶酶解綠豆分離蛋白單因素實驗

1.2.6.1 pH對酶解的影響 實驗選擇在Protex-6L復合蛋白酶的工作pH范圍內（pH8～10），以溫度65℃，底物濃度9%，酶濃度6000U/g條件下，酶解4h。分別考察了pH為8.0、8.5、9.0、9.5和10.0對酶解綠豆分離蛋白制備多肽的影響，測其多肽得率。

1.2.6.2 溫度對酶解的影響 實驗在Protex-6L復合蛋白酶的工作溫度范圍為50～70℃，在pH9，底物濃度9%，酶濃度6000U/g條件下，酶解4h。分別考察了溫度在50、55、60、65、70℃對酶解綠豆分離蛋白制備多肽的影響，測其多肽得率。

1.2.6.3 底物濃度對酶解的影響 實驗選擇底物濃度范圍為6%～10%，在pH9，酶解溫度60℃，酶濃度6000U/g條件下，酶解4h。分別考察了底物濃度在6%、7%、8%、9%和10%時對酶解綠豆分離蛋白制備多肽的影響，測其多肽得率。

1.2.6.4 加酶量對酶解的影響 實驗選擇酶濃度范圍為4000～8000U/g，在pH9，酶解溫度60℃，底物濃度9%條件下，酶解4h。分別考察加酶量在4000、5000、6000、7000、8000U/g對酶解綠豆分離蛋白多肽的影響，測其多肽得率。

1.2.6.5 酶解時間對酶解的影響 實驗選擇在pH9，酶解溫度60℃，底物濃度8%，酶濃度6000U/g條件下，分別酶解2、3、4、5、6h。考察其對酶解綠豆分離蛋白多肽的影響，測其多肽得率。

1.2.7 響應面分析法 以單因素實驗為基礎，利用Design Expert7.1.1軟件設計，進一步對實驗參數進行優化，因素水平見表1。

表1 因素水平表

2 結果與分析

2.1 Protex-6L堿性蛋白酶酶解綠豆分離蛋白制備多肽的單因素實驗

2.1.1 pH對多肽得率的影響 pH對酶促反應的影響主要有：在不適的酸堿環境中，酶的空間構象會發生改變，可能導致酶失活；同時pH決定了底物與酶的解離狀態，影響它們的結合，從而影響蛋白質的水解程度，對制得的多肽質量有所影響。實驗結果（見圖1）表明，Protex-6L堿性蛋白酶在pH=9.0時多肽得率較高。

圖1 pH對酶解反應的影響

2.1.2 溫度對酶解的影響 溫度對酶促反應影響的原因概括地說主要有兩個方面：一是溫度對蛋白酶穩定性的影響，即對酶熱變性失活作用；二是溫度對酶促反應本身的影響，其中可能包括影響酶和底物的結合，影響最大速率（Vmax），影響酶和底物分子解離基團的解離常數（pK），影響酶與抑制劑、激活劑或輔酶的結合等。實驗結果（見圖2）表明，Protex-6L堿性蛋白酶在溫度為65℃時多肽得率較高。

圖2 溫度對酶解反應的影響

2.1.3 底物濃度對酶解的影響 過高的底物濃度易造成水解液黏度增大，影響蛋白酶的擴散，對蛋白質鏈斷裂反應有抑制作用。在底物濃度一定的時候，理論上酶分子越多，則酶與底物之間作用越頻繁。隨著底物濃度的減少，底物相對酶的濃度減少。當底物濃度小到一定程度時，酶的數量就趨于過剩，單位時間內一部分酶分子不與底物結合，造成蛋白質鏈斷裂反應變緩慢。實驗結果（見圖3）表明，Protex-6L堿性蛋白酶在底物濃度8%時多肽得率較高。

圖3 底物濃度對酶解的影響

2.1.4 加酶量對酶解的影響 在蛋白質的酶解實驗中，增大酶濃度可以增加酶與底物之間結合的幾率，從而增強酶解程度。當酶濃度增加到一定值后，上升的趨勢減緩。因此，對于酶的添加量需要進行權衡。實驗結果（見圖4）表明，Protex-6L堿性蛋白酶在酶濃度在6000、7000U/g時多肽得率較高，但是增長趨勢不明顯，為了經濟效應考慮，選擇6000U/g酶濃度為好。

圖4 加酶量對酶解的影響

2.1.5 酶解時間對酶解的影響 隨著酶解時間的延長，水解度逐漸增大，這是由于隨時間的延長，蛋白酶逐漸作用，直至酶全部飽和，這時蛋白水解度達最大值，但隨著時間繼續延長，由于有少量水解的肽鏈又重新連接，導致其水解度不再增高，反而略微下降，使得多肽得率下降。實驗結果（見圖5）表明，Protex-6L堿性蛋白酶在4h多肽得率達最高值，再繼續酶解，多肽得率有所下降。

圖5 酶解時間對酶解的影響

2.2 響應面實驗結果

在單因素實驗的基礎上，根據Box-Behnken中心組合設計原理，本實驗以多肽得率Y為響應值，利用Design Expert7.1.1軟件設計了5因素3水平的響應面法實驗，共有46個實驗點，其中40個為析因點，6個為零點以估計誤差。實驗設計和結果見表2，方差分析見表3。

表2 Box-Behnken設計方案及響應值結果

2.2.1 方差分析 利用軟件對實驗結果進行二次多元回歸擬合，對表2的數據進行方差分析后得到模型的二次多項回歸方程為：

表3 方差分析表

由表3可知，方程因變量與自變量之間的線性關系明顯，該模型回歸顯著（p＜0.0001），失擬項不顯著，并且該模型R2=93.82%，R2Adj=88.87%，說明該模型與實驗擬合良好，自變量與響應值之間線性關系顯著，可以用于該反應的理論推測。由F檢驗可以得到因子貢獻率為：x4＞x5＞x3＞x1＞x2，即加酶量＞酶解時間＞底物濃度＞酶解pH＞酶解溫度。

2.2.2 響應面分析 應用響應面優化分析方法對回歸模型進行分析如圖4，可以看出pH（x1）與酶解溫度（x2）、pH（x1）與加酶量（x4）、酶解溫度（x2）與底物濃度（x3）、酶解溫度（x2）與酶解時間（x5）以及加酶量（x4）與酶解時間（x5）的交互作用對水解度的影響。由此可知，酶解溫度在55～65℃范圍內，酶解時間對水解度的因子貢獻率雖然小，但酶解溫度與其他因素的交互作用對多肽得率影響較大。

2.2.3 最佳水解條件的預測和驗證 用DesignExpert7.1.1軟件進行優化，優化方案有29組，經過實驗驗證：pH9.37、酶解溫度為55℃、底物質量分數7.0%、酶量5000.02U/g、酶解時間為4.76h、肽得率最優值為91.37%。說明優化后的回歸方程對綠豆分離蛋白的水解進行分析和預測是非常可靠的。

3 結論

圖6 各酶解參數交互顯著項對多肽得率的響應面分析

選用Protex-6L堿性蛋白酶對綠豆分離蛋白進行酶法水解制備多肽，經實驗證明是可行的，其多肽得率可達到91.37%。且Protex-6L堿性蛋白酶是現有蛋白酶中水解度較高、穩定性好、應用廣泛的一種，為以后工業化生產可提供一定的理論依據。實驗所得的最優條件是pH9.37、酶解溫度為55℃、底物質量分數7.0%、酶量5000.02U/g、酶解時間為4.76h。

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Study on preparation of small peptides by hydrolyzing isolate mung bean protein with Protex-6L proteinase

LI Yang1,2,JIANG Lian-zhou1,2,*,WANG Mei1,LIU Qi1
（1.Food College，Northeast Agricultural University，Harbin 150030，China；2.Soy Bean Engineering Technique Research Center，Harbin 150030，China）

Protex-6L proteinase was used to hydrolyzing isolated mung bean protein，in order to prepare small peptides.Index was investigated by peptide yield，its enzymatic hydrolysis was studied.Based on single factor experiments，the effects of hydrolysis conditions:pH，reaction temperature，substrate concentration，enzyme dosage，reaction time were studied.Design by Design Expert7.1.1 to optimize the response of the face of hydrolysis conditions.The results showed that pH 9.37，reaction temperature 55℃，7.0%substrate concentration，enzyme 5000.02U/g under the conditions of hydrolysis 4.76h，peptide yield was 91.37%.

Protex-6L protease；peptide yield；response surface

TS201.2+5

B

1002-0306（2011）10-0384-05

綠豆（Vignaradiata）又名青小豆，古名菉豆、植豆，屬豆科豇豆屬，原產于我國，種植歷史悠久，分布廣泛，產量豐富。綠豆營養成分全面，蛋白質含量達19.5%～33.1%，功效比為1.87，遠高于小麥、稻谷、玉米等糧食作物；且氨基酸種類齊全、配比均衡[1]，特別是賴氨酸的含量較為豐富，接近雞蛋蛋白質[2]。其味甘、性寒，有清熱解毒、消暑止渴、利尿消腫、解毒保肝之功效，具有良好的食用和藥用價值。目前對綠豆的利用多側重于綠豆淀粉，而忽略了綠豆蛋白的開發，造成了資源浪費，增加了下游處理成本[3]。綠豆肽是綠豆分離蛋白經水解而成的低聚肽混合物，相比綠豆蛋白，其氨基酸組成與結構幾乎沒有改變，但相對分子質量較小，具有水溶性高、黏度低、穩定性強等優點。其吸收機制優于游離氨基酸[4]，有抗腫瘤、抗菌、抗病毒、抗氧化、免疫調節、降血脂、降膽固醇等作用[5]，用作食品原料，還可以降低食品硬度，改善口感，因此具有廣闊的市場開發前景。現代營養學研究表明，人體攝入的蛋白質經消化道中的酶作用后，大多是以寡肽的形式被消化吸收，而以游離氨基酸形式被吸收的比例很小，因此開發有益于人類健康的功能性肽具有廣闊的市場前景[6-7]。本文采用Protex-6L復合蛋白酶，酶解綠豆分離蛋白制備低聚肽和氨基酸混合物，作為食物添加劑，具有廣泛的用途。

2011-08-01 *通訊聯系人

李楊（1981-），男，講師，研究方向：糧食、油脂及植物蛋白工程。