表沒食子兒茶素沒食子酸酯的提取分離工藝研究

郭秋韻，康麗紅，李 露，徐 昆，張學俊

（中北大學理學院，山西太原030051）

表沒食子兒茶素沒食子酸酯的提取分離工藝研究

郭秋韻，康麗紅，李 露，徐 昆，張學俊

（中北大學理學院，山西太原030051）

采用無水乙醇對茶葉進行浸提，用乙酸乙酯和蒸餾水分別對浸提液進行萃取后濃縮包含表沒食子兒茶素沒食子酸酯[epigallocatechin gallate，（-）-EGCG]在內的黃酮類物質。利用聚酰胺裝填的層析柱對茶葉中的（-）-EGCG進行分離，并對分離產品結果進行分析。本實驗以活性炭為脫色劑，考察了活性炭的用量、脫色時間、脫色次數、脫色后溶液pH、乙酸乙酯與水的配比以及洗脫劑中乙醇濃度等條件對實驗結果產生的影響。在各項條件最優的情況下，每10g綠茶可以提取出純度大于98%的（-）-EGCG單體0.39g。

表沒食子兒茶素沒食子酸酯，聚酰胺，活性炭，純度，產率

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

綠茶 安徽天方茶葉公司；聚酰胺 粒徑60～90目，江蘇臨江化工試劑廠；活性炭 粉末；乙酸乙酯 色譜純；（-）-EGCG標準品 長沙華欣科技公司；冰醋酸 優級純；98%乙醇。

玻璃層析柱 規格500mm×20mm，定制；旋轉蒸發器 Waters 600型高效液相色譜儀（HPLC）；UV2300紫外分光光度儀 上海天美科學儀器有限公司；Nicolet 6700傅立葉紅外光譜儀，POLAX-2L旋光儀。

1.2 實驗方法

1.2.1 茶多酚的浸提與分離 將10g茶葉在烤箱中進行烘干后碾成碎末狀，在漏斗出口堵上脫脂棉后，將茶葉裝入恒壓滴液漏斗中，并向其中裝入無水乙醇。使用循環冷凝裝置并用水浴加熱，溫度在87℃左右。當有冷凝液滴出時，開始計時，2h后，改換蒸餾裝置濃縮提取液。向提取液中加入活性炭粉末后進行脫色，抽濾并收集濾液，用10%的檸檬酸溶液調節濾液的pH，再向其中加入一定比例的乙酸乙酯與水進行萃取[6]，取上層油酯層并使用旋轉蒸發器回收乙酸乙酯，干燥，得茶多酚粗品。

1.2.2 聚酰胺的預處理 將聚酰胺置于乙醇中攪拌，并進行24h的浸泡處理，過濾后，濾餅每次使用20mL的乙醇沖洗3次（乙醇可回收并重復使用）。將處理好的聚酰胺倒入層析柱中，使聚酰胺自然沉降，放出柱內多余的乙醇溶液，使液面略高于聚酰胺顆粒表面后關閉活塞，再分別用濃度為5%的NaOH溶液、10%的醋酸溶液洗滌[4]，最后用蒸餾水沖洗至流出液pH為7。

1.2.3 （-）-EGCG的分離與收集 將所得的茶多酚粗品加適量蒸餾水溶解后上聚酰胺柱。先用100mL蒸餾水洗脫，控制流速為4mL/min，當層析柱內液面略高于聚酰胺柱體高度時，使用一定濃度的乙醇—水溶液進行洗脫，流速為3.0mL/min，至洗脫完全。將含（-）-EGCG的流份合并，回收乙醇，在40℃的溫度下進行蒸發干燥，回收得（-）-EGCG固體粉末。

2 結果與討論

2.1 產物的結構表征

2.1.1 旋光度測定 在20℃的恒溫條件下，測定提取物的比旋光度，所得結果為[α]D=-172.0（c=1.0，乙醇）。

2.1.2 紅外光譜 如圖1所示，提取物的紅外光譜在1680cm-1處有一組較強的C-O伸縮振動吸收峰，在1200～1240cm-1處有一組較強的C-O-C非對稱伸縮振動吸收峰，在1450～1620cm-1處有苯環骨架特征振動吸收峰，與文獻[1]報道一致。

圖1 （-）-EGCG的紅外光譜圖

2.1.3 結構分析 （-）-EGCG的分子構型見圖2。（-）-EGCG是α-連苯酚基苯并吡喃與沒食子酸形成的酯，其分子結構中有8個酚羥基。在通過聚酰胺柱層析時，分子的吸附能力與酚羥基的數目有關，數目越多，吸附力越強；同時，分子內芳香化程度越高，共軛雙鍵越多，則吸附力越強。所以，與其他兒茶素中成分相比極性較強，（-）-EGCG與聚酰胺分子間的吸附力很強。通過（-）-EGCG的這一特殊性質，可以利用聚酰胺柱層析法對其進行純化。

圖2 （-）-EGCG的分子構型

2.2 活性炭對（-）-EGCG脫色效果的影響因素分析

通過使用紫外光譜對用活性炭脫色后的溶液吸光度的測量[6]，同時參考（-）-EGCG的產率及純度，分析影響（-）-EGCG脫色效果的因素，進行正交實驗，實驗因素水平見表1，結果見表2。

表1 正交實驗因素水平表

表2 正交實驗結果

由表2可知，A、B、C三因素對脫色效果影響的顯著性依次為B＞A＞C，其理論最優水平則為A4B4C4，在此條件下溶液的吸光度為0.0142。

2.2.1 活性炭質量的影響 隨著活性炭加入量增加，脫色效果逐漸增強，但當加入的活性炭達到一定量時，實驗結果變化較小。使用過量的活性炭會對溶液中（-）-EGCG產生吸附作用，致使目標產物（-）-EGCG的產量下降。經多次實驗發現，當活性炭處于水平3時，脫色與產出的綜合效果最好。

2.2.2 脫色次數的影響 在對樣品分別進行多次脫色后發現，經兩次脫色后的溶液吸光度基本不變。而脫色次數過多會造成活性炭的浪費，同時在過濾分離的過程中產生（-）-EGCG的損耗，直接導致目標產品產量的降低。故脫色次數處于水平2時，達到的脫色效果最佳。

2.2.3 脫色時間的影響 隨著時間的增加，脫色效果顯著增強，但當脫色時間達到30min后，則脫色液中葉綠素含量吸收度變化不大。當脫色時間過長，會導致（-）-EGCG被活性炭吸附，從而使（-）-EGCG產量下降。

綜上所述，增大活性炭用量、增加脫色次數或延長脫色時間都會增加活性炭對產物的吸附，使產量下降；但減少活性炭用量、脫色次數及脫色時間則會導致茶多酚粗品的脫色不徹底，從而使實驗終產物（-）-EGCG的純度不高。故實際所選取的最佳水平為A3B2C3，即分兩次對溶液進行脫色，每次加入1.3g活性炭粉末，脫色時間為30min，此條件下脫色后溶液的吸光度為0.0149。

2.3 脫色后溶液不同pH對（-）-EGCG分離效果的影響

乙酸乙酯萃取前用檸檬酸調節濾液[7]，使反應液達到不同pH。實驗結束后收集（-）-EGCG并精確稱量其產量，結果見圖3。

圖3 pH對（-）-EGCG分離效果的影響

從圖3中可以看出，隨著pH的增加，提取效果增強，（-）-EGCG的產量增加，當pH為4.0時，每10g茶葉中（-）-EGCG的產量達到最大值，約為0.39g；而當pH＞4時，隨著pH的增加，提取效果逐漸變差。在調節pH時，應控制在4.0左右，這樣有利于（-）-EGCG的分離。

茶葉中含有包含咖啡堿在內的各種堿性物質，通過調節pH來中和溶液中的堿性物質，但當pH過低即溶液酸度過大時，會使目標產物（-）-EGCG分子中的酯鍵發生水解反應，從而降低（-）-EGCG的產量。

2.4 萃取劑配比對萃取效果的影響

在萃取劑中水的體積不變并與溶液中乙醇的體積相同的情況下，將水與乙酸乙酯按不同比例配制后萃取反應溶液。待靜置分層后取上層酯相，并用0.45μm的濾膜過濾，經HPLC檢測，所得數據如表3。

在萃取過程中，溶液中的乙醇與萃取劑中的水、乙酸乙酯分別能夠完全互溶，而水與乙酸乙酯則存在部分互溶現象。隨著三組分比例不同，平衡時兩液相的組成也相應發生變化。在溶液中乙醇體積不變的情況下，隨著乙酸乙酯所占比例的增加，乙醇中的（-）-EGCG逐漸向溶解度較大的乙酸乙酯中移動，從而達到萃取濃縮的目的；但當乙酸乙酯比例進一步增加時，體系中的水也同時開始與乙酸乙酯互溶，兩液相組成越來越接近，甚至在某一點時可以形成同一液相，從而對后面的分離過程造成困難。由實驗結果可知，當水與乙酸乙酯的配比為1∶3時，萃取的效果最好。

表3 萃取劑配比對萃取效果的影響

2.5 流動相組成對分離效果的影響

乙醇和水的混合液的流動相[8]中，分別取乙醇所占的體積比為50%、60%、70%、80%、90%、100%進行分離。六次所得酯相均經HPLC檢測[9]，以體積比為橫坐標，以（-）-EGCG的峰高與表兒茶素（EC）峰高的比值為縱坐標作圖。由圖可得，乙醇的體積比為90%時的分離效果最好。

圖4 流動相對EGCG分離效果的影響

3 結論

3.1 每10g茶葉使用總量為2.6g的活性炭，分兩次進行脫色，每次脫色時間為30min，所得茶多酚粗品的脫色效果最好。

3.2 脫色后溶液的pH、水與乙酸乙酯的配比及洗脫劑中乙醇的濃度對（-）-EGCG產量及純度有明顯影響，當萃取液的pH為4.0，水與乙酸乙酯的配比為1∶3，流動相中乙醇含量為90%時所得結果最好。

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Study on extraction and separation of epigallocatechin gallate

GUO Qiu-yun,KANG Li-hong,LI Lu,XU Kun,ZHANG Xue-jun
（Department of Science,North University of China,Taiyuan 030051,China）

Using anhydrous alcohol to extract of tea，and using ethyl acetate and distilled water to soak mention fluid respectively to extract enrichment flavonoids substances which contains epigallocatechin gallate.Then using polyamide chromatography column in the(-)-EGCG separation，and analysis the results.The active carbon was used as decoloring agents，at the same time to examine the dosage of activated carbon，decoloring time and decoloring number，the pH of bleaching solution，the proportion of ethyl acetate and water and the ethanol concentration of elution agents which had influence on experimental results.In the conditions of optimal，each 10g green tea could extract the(-)-EGCG monomer about 0.39g which purity was higher than 98%.

epigallocatechin gallate；polyamide；activate carbon；purity；yield

TS272

B

1002-0306（2011）10-0358-04

兒茶素是茶葉中含量豐富且功能重要的一類物質，其成分主要包括表兒茶素（EC）、表兒茶素沒食子酸酯（ECG）和表沒食子兒茶素沒食子酸酯[（-）-EGCG]等，而（-）-EGCG是兒茶素中最有效的活性成分，約占綠茶毛重的8%～13%，也是兒茶素中含量最高的組分[1]。（-）-EGCG是α-連苯酚基苯并吡喃與沒食子酸形成的酯，具有酚類抗氧化的通性，其分子結構中有6個鄰位的酚羥基，因此有優于其它兒茶素的許多性質。并具有抗菌消炎、抗氧化和抗突變的作用，也可用作為腫瘤多藥耐藥性的逆轉劑，能夠改善癌細胞對化療的敏感性，減輕對心臟的毒性，還有保護內皮的作用，可以有效促進血管舒張，減少心血管疾病的發生[2]。高純度（-）-EGCG與茶多酚提取物相比，具有有效成分明確、沒有雜質副作用干擾、活性更強等優點，因此分離純化（-）-EGCG具有重要意義。目前，（-）-EGCG的主要分離方法主要有HPLC分離、葡萄糖凝膠分離、超臨界流體萃取、柱層析法等[2-3]。由于吸附型填料價格便宜，具有吸附能力強、解吸容易、穩定性高、可再生、反復使用等優點[4-5]，本文在前人的研究基礎上，使用聚酰胺為柱色譜填料，對茶葉中（-）-EGCG的分離、純化工藝條件進行優化實驗。

2010-11-15

郭秋韻（1990-），女，本科生，研究方向：天然產物的提取與分離。