堿溶酸沉法提純玉米浸泡水粗蛋白的工藝優(yōu)化

魯晶晶，鄭喜群,*，劉曉蘭，劉志勝

（1.齊齊哈爾大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，黑龍江省高校農(nóng)產(chǎn)品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江齊齊哈爾161006；2.美國(guó)北達(dá)科他州立大學(xué)谷物與食品科學(xué)系，美國(guó)北達(dá)科他州581052）

堿溶酸沉法提純玉米浸泡水粗蛋白的工藝優(yōu)化

魯晶晶1，鄭喜群1,*，劉曉蘭1，劉志勝2

（1.齊齊哈爾大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，黑龍江省高校農(nóng)產(chǎn)品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江齊齊哈爾161006；2.美國(guó)北達(dá)科他州立大學(xué)谷物與食品科學(xué)系，美國(guó)北達(dá)科他州581052）

以玉米浸泡水粗蛋白為原料，通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)初步確定堿溶酸沉法提純玉米浸泡水粗蛋白的條件。在單因素基礎(chǔ)上選取影響蛋白質(zhì)提純效果明顯的三個(gè)因素：堿溶階段pH、浸提時(shí)間、料液比，進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì)。得到了優(yōu)化的提純條件：溫度45℃，堿溶階段pH12，浸提時(shí)間20min，料液比（W∶V）1∶35、酸沉階段pH5.5。在此條件下，玉米浸泡水的蛋白質(zhì)含量為91.84%，提取率為70.06%。

玉米浸泡水，蛋白，提純，優(yōu)化

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

玉米浸泡水 青岡龍鳳淀粉廠(chǎng)；玉米浸泡水粗蛋白 實(shí)驗(yàn)室自制，殼聚糖絮凝提取冷凍干燥后，100目過(guò)篩，蛋白質(zhì)26.44%、水分9.34%、總糖0.62%、總酸1.15%、脂肪1.02%、灰分30.66%；其他試劑 分析純。

Wmzk-72電熱恒溫水浴鍋 上海躍進(jìn)機(jī)械廠(chǎng)；Thermo702型低溫冰箱 賽默飛世爾科技公司；TDL-5-A臺(tái)式離心機(jī) 上海安亭科技儀器廠(chǎng)；PHS-3C型pH計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司；全自動(dòng)凱氏定氮儀 瑞士步琪公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 玉米浸泡水粗蛋白的制備

1.2.1.1 玉米浸泡水粗蛋白的制備 用殼聚糖絮凝的方法從玉米浸泡水中提取[5]。取玉米浸泡水1000mL，調(diào)節(jié)浸泡水pH6.9，添加10g/L殼聚糖溶液，60r/min攪拌35min，靜置30min，離心，沉淀物干燥，粉碎，100目過(guò)篩，于常溫保存?zhèn)溆谩Ｓ衩捉菟值鞍字械鞍踪|(zhì)含量的測(cè)定采用常量凱氏定氮法。

1.2.1.2 玉米浸泡水粗蛋白的提純步驟 稱(chēng)取2.0g玉米浸泡水粗蛋白，溶于蒸餾水中，用0.5mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH，恒溫水浴振蕩浸提20min，然后3500r/min離心20min，殘?jiān)瓷鲜龇椒ㄔ偬崛∫淮危喜纱翁崛〉纳锨逡海?.5mol/L HCl分別調(diào)pH，靜置30min，有沉淀析出，3500r/min離心20min，棄去上清液，沉淀冷凍干燥，玉米浸泡水蛋白，進(jìn)行三次平行實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 堿溶酸沉單因素實(shí)驗(yàn)

1.2.2.1 堿溶階段最適pH的確定 按料液比1∶25（w∶v），分別調(diào)節(jié)pH至9、10、11、12、13、14，于25℃浸提30min，酸沉階段調(diào)pH至5.0，研究堿溶階段pH對(duì)蛋白質(zhì)提取率及蛋白質(zhì)純度的影響，確定適宜的堿溶階段pH。

1.2.2.2 適宜溫度的確定 堿溶階段pH為12，分別選擇溫度為25、35、45、55、65℃，其他條件同1.2.2.1，確定適宜的浸提溫度。

1.2.2.3 適宜料液比的確定 分別按料液比1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40、1∶45（w/v），堿溶階段pH為12，浸提溫度為45℃，其他條件同1.2.2.1，確定適宜的料液比。

1.2.2.4 適宜浸提時(shí)間的確定 按料液比1∶35（w/v），堿溶階段pH為12，浸提溫度45℃，分別選擇浸提時(shí)間為10、20、30、40、50、60min，其他條件同1.2.2.1，確定適宜的浸提時(shí)間。

1.2.2.5 適宜酸沉階段pH的確定 按料液比1∶35（w/v），堿溶階段pH為12，浸提溫度為45℃，浸提時(shí)間為20min，分別調(diào)酸沉階段pH至3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0，確定適宜的酸沉階段pH。

1.2.3 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn) 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，采用Box-Behnken進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。以料液比、堿溶階段pH、浸提時(shí)間為自變量，提純后玉米浸泡水蛋白純度為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)3因素3水平共15個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)的響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)[6]。利用Design Exeprt軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和回歸分析。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案如表1所示。

表1 實(shí)驗(yàn)因素和水平

1.2.4 玉米浸泡水粗蛋白的分析

1.2.4.1 玉米浸泡水粗蛋白成分的分析[7]水分、灰分、總糖、總酸、脂肪、蛋白質(zhì)的測(cè)定分別按照GB5009.3-2003直接干燥法、GB5009.4-2003、蒽酮-硫酸法、滴定法、GB5512-1985索氏提取法、GB5009.5-85常量凱氏定氮法測(cè)定。

1.2.4.2 蛋白質(zhì)提取率的計(jì)算

式中：C0-玉米浸泡水粗蛋白的蛋白質(zhì)含量，%（w/w）；C1-提純后樣品蛋白質(zhì)含量，%（w/w）。

1.2.4.3 蛋白質(zhì)純度 堿溶酸沉提純后的玉米浸泡水蛋白質(zhì)樣品中蛋白質(zhì)含量（用常量凱氏定氮法測(cè)定）。

2 結(jié)果與討論

2.1 堿溶酸沉提純玉米浸泡水粗蛋白的單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 堿溶階段適宜pH的選擇 蛋白質(zhì)是兩性電解質(zhì)，pH的變化會(huì)改變其帶電情況，直接影響蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)-溶劑的相互作用，從而使蛋白質(zhì)的溶解性發(fā)生變化。因此，有必要研究堿溶階段pH對(duì)蛋白質(zhì)純度及回收率的影響。按照1.2.2.1實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，堿溶階段適宜pH對(duì)玉米浸泡水粗蛋白提純效果的影響如圖1所示。

圖1 堿溶階段pH對(duì)玉米浸泡水粗提純效果的影響

由圖1可知，隨著pH從9增加到12，樣品蛋白純度和提取率均逐漸增大，堿液對(duì)蛋白質(zhì)分子的次級(jí)鍵特別是氫鍵具有破壞作用，并可使某些極性基團(tuán)發(fā)生解離，使蛋白質(zhì)表面分子具有相同的電荷，從而對(duì)蛋白質(zhì)分子具有增溶的作用。所以，隨著溶液pH的逐漸增大，提取率及蛋白純度也逐漸增大；pH大于12時(shí)，蛋白純度和提取率均減小；當(dāng)pH14時(shí)，蛋白純度最小，甚至比玉米浸泡水粗蛋白的純度還低。分析可能是pH過(guò)高使蛋白質(zhì)發(fā)生變性，導(dǎo)致蛋白質(zhì)內(nèi)部結(jié)構(gòu)及空間構(gòu)象遭到破壞，失去原來(lái)的天然性質(zhì)，使得最后得到的蛋白純度極低。因此，確定pH12為適宜堿溶階段pH。

2.1.2 適宜溫度的選擇 按照1.2.2.2實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，溫度對(duì)玉米浸泡水粗蛋白提純效果的影響如圖2所示。

由圖2可以看出，隨著溫度的升高，蛋白純度及提取率均有所下降，但變化不明顯。蛋白質(zhì)在不同溫度條件下有不同的溶解度，尤其對(duì)于含有較多疏水性氨基酸的玉米浸泡水粗蛋白來(lái)講，在堿性條件下的溶解性比較好，但當(dāng)溫度升高時(shí)疏水基團(tuán)會(huì)暴露出來(lái)，形成由二硫鍵連接的高分子量不溶聚合物，使蛋白質(zhì)在溶液中的溶解度下降，在堿溶過(guò)程結(jié)束后，離心棄去沉淀收集上清液的環(huán)節(jié)中損失掉，將這部分不溶的固形物離心棄去，導(dǎo)致堿溶酸沉后的蛋白純度及提取率降低。在實(shí)驗(yàn)所選擇的溫度范圍內(nèi)，25℃時(shí)，蛋白純度及提取率均最高。但考慮到淀粉廠(chǎng)生產(chǎn)淀粉時(shí)產(chǎn)生的玉米浸泡水的實(shí)際溫度為45℃，所以，最終確定適宜的提取溫度為45℃，更有益于實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。

圖2 溫度對(duì)玉米浸泡水粗蛋白提純效果的影響

2.1.3 適宜料液比的選擇 料液比在一定范圍內(nèi)的提高可以大大提高蛋白質(zhì)的提取率，較高的料液比可以降低體系的粘度，加快傳質(zhì)的過(guò)程；料液比小時(shí)，溶液的粘度較大，將影響傳質(zhì)過(guò)程的進(jìn)行；而適宜的料液比可以促進(jìn)原料與溶液的接觸[8]。所以，選擇適宜的料液比尤為重要。按照1.2.2.3實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，料液比對(duì)玉米浸泡水粗蛋白提純效果的影響如圖3所示。

圖3 料液比對(duì)玉米浸泡水粗蛋白提純效果的影響

由圖3可知，在實(shí)驗(yàn)所選的料液比范圍內(nèi)，隨著料液比的增大，樣品蛋白質(zhì)的純度及提取率呈先增大后減小的趨勢(shì)。料液比為1∶35時(shí)蛋白純度及提取率都最大，繼續(xù)增加料液比，兩項(xiàng)指標(biāo)都有下降。含水量多少直接影響傳質(zhì)過(guò)程的相互作用，料液比過(guò)大時(shí)，料液體系分散不均勻，不利于蛋白質(zhì)的充分溶解，使得蛋白質(zhì)的提取率偏低，提取出來(lái)的樣品中有效蛋白含量沒(méi)有增加；同時(shí)，料液比過(guò)大，提取時(shí)消耗大量的堿和水，所得提取液的蛋白質(zhì)濃度非常低，大大增加了后處理的負(fù)擔(dān)，產(chǎn)品成本增加，會(huì)帶來(lái)一定的負(fù)面影響。因此，適宜料液比為1∶35。

2.1.4 適宜浸提時(shí)間的選擇 按照1.2.2.4實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，浸提時(shí)間對(duì)玉米浸泡水粗蛋白提純效果的影響如圖4所示。

圖4 浸提時(shí)間對(duì)玉米浸泡水粗蛋白提純效果的影響

由圖4可以看出，隨浸提時(shí)間的延長(zhǎng)，蛋白質(zhì)純度及提取率呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)，在50min時(shí)提取率又有微小的增加，之后提取率繼續(xù)下降。分析得出上述結(jié)果的原因：第一可能是溶劑接觸到蛋白質(zhì)需要一定的時(shí)間，才能使蛋白質(zhì)逐步水化而緩慢地溶出，時(shí)間過(guò)短，溶劑與蛋白質(zhì)接觸不充分，溶質(zhì)溶解效果不好；浸提時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，溶質(zhì)飽和，溶解效果反而下降，導(dǎo)致溶質(zhì)緩慢溶出，降低了溶質(zhì)的溶解度；第二可能是樣品結(jié)構(gòu)的松散程度越來(lái)越接近于極限，蛋白質(zhì)從樣品中進(jìn)入提取液主體的傳質(zhì)速率明顯降低，使提取率增加平緩[9]。因此，確定適宜浸提時(shí)間為20min。

2.1.5 適宜酸沉階段pH的選擇 本文選取堿溶液將蛋白質(zhì)充分溶解，為了收集蛋白質(zhì)就需要將其從堿溶液中析出，所以酸沉階段pH也有可能影響著蛋白質(zhì)的純度及提取率，也就有必要考察酸沉階段pH對(duì)蛋白質(zhì)提純效果的影響，按照1.2.2.5實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，如圖5所示。

圖5 酸沉階段pH對(duì)玉米浸泡水粗蛋白提純效果的影響

由圖5可以看出，酸沉階段玉米浸泡水粗蛋白的蛋白純度及提取率隨pH變化呈先增大后減小的趨勢(shì)，在pH5.5時(shí)，均達(dá)到最大值，分別為88.00%、68.74%。蛋白質(zhì)是兩性電解質(zhì)，在某一pH的溶液中，它所帶的正電荷與負(fù)電荷數(shù)恰好相等，即凈電荷為零，此時(shí)蛋白質(zhì)間靜電排斥作用最低，蛋白質(zhì)聚集、沉淀，溶解度最低，從溶液中析出。因此，酸沉階段適宜pH為5.5。

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化堿溶酸沉提純玉米浸泡水粗蛋白的適宜條件

2.2.1 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 采用三因素三水平的響應(yīng)面法，優(yōu)化堿溶酸沉提純玉米浸泡水粗蛋白的工藝條件。按照1.2.3方法實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表2。

2.2.2 模型的建立及顯著性檢驗(yàn) 運(yùn)行Design Exeprt軟件，對(duì)表2的結(jié)果進(jìn)行二次項(xiàng)擬合，在α=0.05水平上用逐步回歸法予以簡(jiǎn)化，求得玉米浸泡水蛋白純度對(duì)料液比（A）、堿溶階段pH（B）、浸提時(shí)間（C）的二次多項(xiàng)回歸模型：

對(duì)該回歸模型及回歸方程的各項(xiàng)系數(shù)進(jìn)行方差分析、顯著性檢驗(yàn)，結(jié)果如表3所示。

表3 方差分析結(jié)果

從表3可以看出：模型P=0.0011＜0.01，表明模型方程高度顯著，即不同條件對(duì)玉米浸泡水粗蛋白提純效果影響高度顯著；整個(gè)模型的R2為0.9791，說(shuō)明模型可以解釋97.91%實(shí)驗(yàn)所得玉米浸泡水蛋白提取純度的變化，模型的擬合度較好，可以用于堿溶酸沉法提純玉米浸泡水粗蛋白實(shí)驗(yàn)的理論預(yù)測(cè)。

由表3的回歸方程的各項(xiàng)系數(shù)顯著性檢驗(yàn)可知，二次項(xiàng)（P=0.0002＜0.05）對(duì)玉米浸泡水粗蛋白提純效果影響高度顯著，一次項(xiàng)（P=0.0451＜0.05）影響較顯著，而交互項(xiàng)（P=0.2078＞0.05）作用不顯著。

2.2.3 玉米浸泡水粗蛋白堿溶酸沉提純工藝的響應(yīng)面分析與優(yōu)化 根據(jù)回歸模型，做出相應(yīng)的響應(yīng)曲面圖，如圖6所示。

由圖6可知，各因素對(duì)響應(yīng)值的影響趨勢(shì)可通過(guò)這組圖直接反映出來(lái)。B（堿溶階段pH）對(duì)響應(yīng)值的影響較大，表現(xiàn)為曲線(xiàn)較陡；A（料液比），C（浸提時(shí)間）對(duì)響應(yīng)值的影響均較小，表現(xiàn)為曲線(xiàn)相對(duì)平滑。另外，回歸方程存在穩(wěn)定點(diǎn)，即極大值點(diǎn)，通過(guò)嶺嵴分析（ridge analysis）得到極大值。所對(duì)應(yīng)的各主要因素 （A，B，C） 的編碼值分別為 （0.020158，-0.103079，0.009576），即適宜條件是：料液比（W∶V）1∶35.10﹑堿溶階段pH 11.90﹑浸提時(shí)間20.10min，在此條件下，蛋白質(zhì)純度的理論值為92.38%。為檢驗(yàn)響應(yīng)曲面法所得結(jié)果的可靠性，采用上述優(yōu)化提純條件進(jìn)行玉米浸泡水粗蛋白提純，考慮到實(shí)際操作的便利，將提取工藝參數(shù)修正為：料液比（W∶V）1∶35，pH12，時(shí)間20min。在此條件下提純，實(shí)際測(cè)得的樣品蛋白質(zhì)含量為91.84%，與理論值較接近。因此，基于響應(yīng)面法所得的優(yōu)化提純工藝參數(shù)準(zhǔn)確可靠，進(jìn)一步驗(yàn)證了數(shù)學(xué)回歸模型的合適性。

圖6 玉米浸泡水粗蛋白經(jīng)堿溶酸沉提純后沉淀的蛋白純度的響應(yīng)面圖

3 結(jié)論

通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)及響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)優(yōu)化了堿溶酸沉方法提純玉米浸泡水粗蛋白的適宜工藝條件。即：溫度45℃；堿溶階段pH12；浸提時(shí)間20min；料液比（W∶V）l∶35；酸沉階段pH5.5，提純后玉米浸泡水蛋白的純度可達(dá)到91.84%，達(dá)到了玉米浸泡水分離蛋白的水平。

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Optimization of purification technology for corn steep water crude protein by alkali-solution and acid-isolation

LU Jing-jing1,ZHENG Xi-qun1,*,LIU Xiao-lan1,LIU Zhi-sheng2
（1.Heilongjiang Provincial Key University Laboratory of Processing Agricultural Products,College of Food and Bioengineering,Qiqihar University,Qiqihar 161006,China；2.North Dakota State University,ND 581052,USA）

The corn steep water crude protein was purified by alkali-solution and acid-isolation.The preliminary conditions were determined through single factor test.By using of response surface analysis experiment，the effects of alkali soluble pH，extracting time，solid-liquid ratio on the protein purity were studied on the base of the single-factor test.The results showed that the optimum conditions were as following:temperature 25℃，alkali soluble pH 12，extraction time 20min，solid-liquid ratio(W∶V)1∶35 and acid subside pH 5.5.Under the best conditions，the protein purity was 91.84%and the yield of protein was 70.06%.

corn steep water；protein；purification；optimization

TS210.1

B

1002-0306（2011）10-0321-05

在玉米淀粉濕法生產(chǎn)過(guò)程中，首先需要浸泡，每處理1t玉米，約產(chǎn)生0.8m3的浸泡水[1]。玉米浸泡水中含有大量有價(jià)值的物質(zhì)，如蛋白質(zhì)、可溶性氨基等。目前，大多數(shù)淀粉廠(chǎng)（尤其是小型淀粉廠(chǎng)）不能對(duì)玉米浸泡水進(jìn)行充分開(kāi)發(fā)利用，而是將玉米浸泡水濃縮成玉米漿作為飼料出售或者直接排放掉，這樣不僅耗費(fèi)大量熱源，造成資源的浪費(fèi)，還會(huì)導(dǎo)致環(huán)境污染[2]。因此，對(duì)玉米浸泡水加以利用，尤其是將其中3%～4%的蛋白質(zhì)提取出來(lái)就顯得尤其重要，既可以變廢為寶，減少環(huán)境危害，還能大大提高經(jīng)濟(jì)效益。玉米浸泡水中蛋白質(zhì)的提取方法，主要有等電點(diǎn)法、三氯乙酸沉淀法等。等電點(diǎn)法分離出的蛋白質(zhì)不到玉米浸泡水中蛋白質(zhì)總量的40%，大部分造成浪費(fèi)；三氯乙酸沉淀法，蛋白質(zhì)回收率為65.3%[3]，但三氯乙酸本身有微毒，給蛋白質(zhì)的利用帶來(lái)一定的問(wèn)題，不能直接加以利用。本課題組也研究過(guò)利用殼聚糖絮凝劑直接從玉米浸泡水中提取玉米浸泡水蛋白，但是得到的蛋白純度不夠，提取率不高。因此，有必要尋求一種安全可靠、成本低、易于實(shí)現(xiàn)操作的提取玉米浸泡水蛋白質(zhì)的方法。堿溶酸沉法是分離提取蛋白質(zhì)應(yīng)用的最多而且已用于產(chǎn)業(yè)化的方法，該法具有操作簡(jiǎn)單、易于控制、成本低廉等優(yōu)點(diǎn)[4]。本實(shí)驗(yàn)以采用殼聚糖絮凝方法提取的玉米浸泡水粗蛋白為原料，利用堿溶酸沉的方法，進(jìn)一步提純玉米浸泡水粗蛋白，并用響應(yīng)面法優(yōu)化提純工藝條件，探討堿溶階段pH、浸提時(shí)間、料液比等因素對(duì)提純后玉米浸泡水蛋白質(zhì)含量的影響，確定適宜工藝參數(shù)，為玉米浸泡水蛋白的開(kāi)發(fā)利用提供理論依據(jù)和參考。

2010-12-28 *通訊聯(lián)系人

魯晶晶（1986-），女，碩士研究生，主要從事農(nóng)產(chǎn)品加工及貯藏方面的研究工作。

黑龍江省海外學(xué)人資助項(xiàng)目（1153h24）。