黃芪經(jīng)側(cè)耳菌發(fā)酵后多糖成分及含量的變化

陳麗艷，李 月，張 迎，金 爽，方自若，王偉明

（黑龍江省中醫(yī)研究院，黑龍江哈爾濱150036）

黃芪經(jīng)側(cè)耳菌發(fā)酵后多糖成分及含量的變化

陳麗艷，李 月，張 迎，金 爽，方自若，王偉明*

（黑龍江省中醫(yī)研究院，黑龍江哈爾濱150036）

以黃芪作為"藥性基質(zhì)"，在一定的條件控制下，運(yùn)用雙向發(fā)酵技術(shù)，經(jīng)側(cè)耳菌發(fā)酵，生成黃芪"藥性菌質(zhì)"，比較黃芪發(fā)酵后多糖成分及含量的變化。采用瓊脂糖凝膠電泳法對(duì)黃芪發(fā)酵前后多糖進(jìn)行定性鑒別，并用蒽酮-硫酸法測定其含量。黃芪發(fā)酵前后多糖的瓊脂糖凝膠電泳呈一個(gè)均一斑點(diǎn)，遷移率分別為0.98和1.21。黃芪發(fā)酵前后多糖得率分別為6.31%和9.50%，含量分別為2.12%和3.64%。結(jié)果表明，瓊脂糖凝膠電泳法可用于黃芪發(fā)酵后多糖的定性鑒別，黃芪經(jīng)側(cè)耳菌發(fā)酵后多糖提取率及含量均明顯增加，充分體現(xiàn)了中藥發(fā)酵可以使其活性成分較大限度釋放的優(yōu)點(diǎn)。

黃芪，側(cè)耳菌，發(fā)酵，多糖

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

側(cè)耳菌（Pleurotus ostreatus） 由黑龍江省科學(xué)院應(yīng)用微生物研究所提供，菌絲體白色，氣生菌絲濃密；黃芪 購自安徽滬譙中藥科技有限公司，由黑龍江省中醫(yī)研究院付克志研究員鑒別為膜莢黃芪，粉碎后過40目篩，水分11.16%；葡萄糖 天津市博迪化工有限公司，分析純；瓊脂糖 北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司，分析純；甲苯胺藍(lán) 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，分析純；四硼酸鈉 天津市東麗區(qū)東大化工廠，分析純。

DYY-12型電泳儀、DYCP-31D型電泳槽 北京市六一儀器廠；高壓滅菌鍋 上海三申醫(yī)療器械有限公司；HZQ-X100振蕩培養(yǎng)箱 中國哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司；GJ75培養(yǎng)箱 齊齊哈爾市醫(yī)汞電子器械廠；LG10-2.4A離心機(jī) 北京醫(yī)用離心機(jī)廠；UV-160A紫外分光光度計(jì) 日本島津。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌質(zhì)的培養(yǎng) 將保存的側(cè)耳菌菌種接種到常規(guī)CPDA培養(yǎng)基上，28℃恒溫培養(yǎng)10d，使菌絲發(fā)育良好，備用。液體培養(yǎng)基：馬鈴薯浸汁20%，葡萄糖2%，硫胺素0.001%，KH2PO40.3%，MgSO4·7H2O 0.15%。將傳代后發(fā)育良好的菌絲接種至經(jīng)滅菌過的液體培養(yǎng)基內(nèi)，28℃、140r/min搖瓶培養(yǎng)7d，要求菌球顆粒大小適當(dāng)，發(fā)酵液澄清。

藥性基質(zhì)培養(yǎng)基：黃芪83%，麥麩15%，CaCO31%，CaSO41%，水100%（按發(fā)酵基質(zhì)干重）。將料拌勻，分裝入袋，121℃滅菌40min。

1.2.2 固體發(fā)酵 將液體種子接種入滅菌后的藥性基質(zhì)培養(yǎng)基中，置于恒溫培養(yǎng)箱于28℃靜止培養(yǎng)40d，取出干燥得黃芪藥性菌質(zhì)。同時(shí)設(shè)一對(duì)照即藥性基質(zhì)培養(yǎng)基，不接種側(cè)耳菌。

1.2.3 多糖的提取 稱取黃芪藥性菌質(zhì)、對(duì)照組及黃芪藥材各100g，加蒸餾水800mL,在80℃水浴浸提2h，提取3次，合并水提液，離心，上清液濃縮至100mL，加95%乙醇至含醇量為30%，靜置12h，減壓抽濾，上清液加95%乙醇至含醇量為80%，靜置12h，減壓抽濾，分離出沉淀用無水乙醇洗滌多次，低溫干燥，即得相應(yīng)多糖粗提物Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ。重復(fù)3次，計(jì)算得率。

1.2.4 瓊脂糖凝膠電泳

1.2.4.1 試劑的配制 電極緩沖液：0.05mol/L硼砂緩沖液，pH9.3；染色劑：0.06%甲苯胺藍(lán)溶于0.5%醋酸中；指示劑：0.1%溴酚藍(lán)溶液；0.2%肝素，樣品多糖均用蒸餾水配成10mg/mL的溶液。

1.2.4.2 電泳鑒別 將1.0%的瓊脂糖凝膠加熱溶解后倒入電泳板中制成3～5mm厚的膠板。各供試品溶液于負(fù)極點(diǎn)樣，點(diǎn)樣量為l0μL，置電泳槽中，加入電極緩沖液，固定電壓110V，電流85mA，功率15W，電泳50min后，0.06%甲苯胺藍(lán)染色10min，用流水沖洗1h脫色，待背景顏色清晰即可[5-6]。脫色后，計(jì)算各樣品的電泳遷移率。

1.2.5 多糖的含量測定[7]

1.2.5.1 對(duì)照品溶液的配制 精密稱取干燥至恒重的葡萄糖對(duì)照品20mg，加蒸餾水溶解，定容于100mL容量瓶中，配成0.2g/L的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別精密吸取標(biāo)準(zhǔn)液1、2、3、4、5mL置于10mL容量瓶中，以蒸餾水定容搖勻，得系列對(duì)照品溶液。

1.2.5.2 蒽酮-濃硫酸溶液的配制 稱取0.2g蒽酮，加100mL濃硫酸，置于棕色瓶中，混合搖勻置于冰箱中（現(xiàn)配現(xiàn)用）。

1.2.5.3 最大吸收波長的確定 以水為空白對(duì)照，取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液與蒽酮-硫酸顯色后，于500～700nm波長范圍內(nèi)掃描，測得最大吸收波長為620nm。

1.2.5.4 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密吸取上述系列對(duì)照品溶液1.0mL，分別置于10mL具塞試管中，將試管置于冰水中，在冰水中分別向試管中加入0.2%蒽酮-硫酸溶液4mL，待各管加完后同時(shí)搖勻，置于沸水浴中加熱10min，取出用冷水迅速冷卻至室溫，放置10min，于620nm處測定吸光度。另精密吸取蒸餾水1.0mL，同法操作，作為空白對(duì)照。以葡萄糖濃度C（g/L）為橫坐標(biāo)，吸光度A為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.5.5 樣品溶液的制備 精密稱取樣品多糖粗提物Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ各10mg，加水溶解并定容至100mL量瓶中，得相應(yīng)的樣品溶液。

1.2.5.6 樣品溶液多糖含量的測定 精密吸取各樣品溶液1.0mL，于10mL具塞試管中，測定吸光度。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，計(jì)算樣品多糖的含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 電泳結(jié)果

黃芪發(fā)酵后多糖在瓊脂糖凝膠上呈單一斑點(diǎn)，斑點(diǎn)位置與其他對(duì)照組多糖的斑點(diǎn)位置也有明顯區(qū)別，肝素、樣品多糖Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ與指示劑相比，電泳遷移率依次為1.08，1.21，0.56，0.98。見圖1。

圖1 黃芪發(fā)酵前后多糖的瓊脂糖凝膠電泳圖譜注：1-溴酚藍(lán)指示劑；2-肝素；3-樣品多糖Ⅰ；4-樣品多糖Ⅱ；5-樣品多糖Ⅲ。

以瓊脂糖凝膠作為電泳介質(zhì)，一般按供試品的電荷密度及分子質(zhì)量進(jìn)行分離，而電泳遷移率的大小主要由供試品自身所帶電荷的多少?zèng)Q定[8]。黃芪經(jīng)側(cè)耳菌發(fā)酵后多糖的電泳遷移率為1.21，未發(fā)酵的黃芪藥材為0.98，表明黃芪發(fā)酵后多糖電荷量有所增加。盡管瓊脂糖凝膠濃度、厚度，緩沖液pH及供試品的點(diǎn)樣量等因素對(duì)電泳結(jié)果均有影響，但其相對(duì)遷移率都很穩(wěn)定，說明該方法可用于多糖的定性鑒別。

2.2 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品制定標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為Y=7.205X+0.1061，相關(guān)系數(shù)r=0.9995。表明在20～100μg范圍內(nèi)葡萄糖的含量與吸光度呈良好線性關(guān)系，見圖2。

圖2 葡萄糖溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3 精密度實(shí)驗(yàn)

取0.06g/L葡萄糖對(duì)照品溶液，重復(fù)測定5次，求得其RSD為2.32%（n=5），精密度良好。

2.4 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

精密吸取黃芪藥性菌質(zhì)多糖溶液，顯色后每隔0.5h測定一次吸光度，連續(xù)4h考察其穩(wěn)定性。結(jié)果吸光度基本無變化，表明樣品溶液顯色后4h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

取多糖粗提物Ⅰ，稱取5份，制備樣品溶液進(jìn)行含量測定。RSD為1.93%（n=5）。結(jié)果表明，本方法重復(fù)性良好。

2.6 回收率實(shí)驗(yàn)

取黃芪藥性菌質(zhì)多糖溶液，加入一定量的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液,混勻后取1.0mL置于具塞試管中，測定吸光度，計(jì)算回收率。結(jié)果平均回收率為102.3%，RSD為2.85%（n=5）。

2.7 多糖的得率及含量的測定結(jié)果

黃芪經(jīng)側(cè)耳菌發(fā)酵后，多糖得率及含量均有明顯的提高，結(jié)果見表1。

表1 多糖的得率及含量測定結(jié)果（%，n=3）

由表1可知，黃芪原藥材（Ⅲ）的多糖得率及含量分別為6.31%和2.12%,對(duì)照組（Ⅱ）分別為6.44%和2.56%,對(duì)照組多糖的得率和含量稍高于原藥材，是因?yàn)闇缇^程中高溫蒸汽使細(xì)胞壁產(chǎn)生徑向收縮應(yīng)力，一定程度上破壞了黃芪細(xì)胞壁的完整性或者大大提高了細(xì)胞壁的通透性，使得多糖更易溶出。而發(fā)酵后黃芪（I）多糖得率和含量明顯提高，得率為9.50%，與對(duì)照組相比高出47.5%，差異顯著（P＜0.05），多糖含量達(dá)到3.64%，與對(duì)照組相比高出42.2%，差異極顯著（P＜0.01）。這可能是由于黃芪中含有大量木質(zhì)素和纖維素，為側(cè)耳菌的生長提供了營養(yǎng)基質(zhì)，誘導(dǎo)側(cè)耳菌產(chǎn)生大量木質(zhì)素酶和纖維素酶，分解黃芪的細(xì)胞壁，促使黃芪多糖從細(xì)胞壁或者蛋白復(fù)合體中游離出來。

黃芪多糖是黃芪的主要活性物質(zhì)之一，具有增強(qiáng)機(jī)體免疫功能、強(qiáng)心、降壓等多種藥理功效[9]。多糖是理想的免疫增強(qiáng)劑，而且對(duì)正常細(xì)胞沒有毒副作用。由于黃芪多糖的多種生物活性及良好的臨床效果,多年來在國內(nèi)外已成為中藥提取及中草藥現(xiàn)代化研究的焦點(diǎn)之一[10-11]。但傳統(tǒng)水提醇沉法黃芪多糖得率一直不高,導(dǎo)致中藥資源的浪費(fèi)和成本的增高，李紅民等[12]采用水提取法得到黃芪得率為3.6%，劉瑞生等[13]采用水提取法黃芪多糖得率為3.6%～4.0%，CaO溶液提取法黃芪多糖得率為5.9%～7.75%,雖有提高但酸堿法提取多糖作用較強(qiáng)烈,多糖活性無法保證。本研究首次選用側(cè)耳菌發(fā)酵黃芪，使多糖的得率及含量達(dá)到9.50%和3.64%，與已往文獻(xiàn)報(bào)道的其它方法提取黃芪多糖的得率及含量相比，有較大輻度的提高，從而使其生物活性得以提高。

3 結(jié)論

3.1 黃芪發(fā)酵后多糖在凝膠中呈現(xiàn)單一斑點(diǎn)，表明其分子自身所帶電荷在一定范圍內(nèi)呈均勻連續(xù)分布；發(fā)酵后多糖的電泳遷移率與未發(fā)酵的電泳遷移率相比有所提高，表明發(fā)酵后電荷量明顯增加，可利用瓊脂糖凝膠電泳對(duì)其進(jìn)行定性鑒別。

3.2 黃芪經(jīng)側(cè)耳菌發(fā)酵后多糖的得率和含量都顯著提高，充分體現(xiàn)了中藥發(fā)酵可以使其活性成分較大限度釋放的優(yōu)點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)室將進(jìn)一步通過HPLC建立黃芪指紋圖譜分析黃芪發(fā)酵前后其他有效成分的變化，對(duì)其藥理藥效作進(jìn)一步的研究。

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The analysis of components and content of polysaccharide in Radix Astragali fermented by Pleurotus ostreatus

CHEN Li-yan，LI Yue，ZHANG Ying，JIN Shuang，F(xiàn)ANG Zi-ruo，WANG Wei-ming*（Heilongjiang Academy of Traditional Chinese Medicine,Harbin 150036,China）

With the bi-directional fermentation technique，Radix Astragali which was taken as drug-containing medium was fermented by Pleurotus ostreatus to obtain Radix Astragali fungal substance，and the change of components and content of polysaccharide in Radix Astragali fermented by Pleurotus ostreatus were investigated.Agarose gel electrophoresis (AGE)was used to study the feasibility of qualitative of determination of polysaccharide in Radix Astragali before and after fermentation，and anthrone-sulphuric acid method was used to determine the polysaccharide content.The electrophoretic results showed that polysaccharide had one spot and had different migration ratio which were 0.98 and 1.21 in raw and fermented materials.The extraction ratio of polysaccharide were 6.31%and 9.50%，while the contents of polysaccharide were 2.12%and 3.64%in raw and fermented Radix Astragali.The results indicated that agarose gel electrophoresis can be used as a qualitative identification method of polysaccharide in fermented Radix Astragali.In addition，after Radix Astragali was fermented by Pleurotus ostreatus，the extraction ratio and content of polysaccharide in Radix Astragali increased obviously.It showed advantage that Chinese medicine fermented by fungi can release active components considerably.

Radix Astragali；Pleurotus ostreatus；fermentation；polysaccharide

TS201.1

A

1002-0306（2011）10-0253-04

黃芪為豆科植物蒙古黃芪Astragalusmembranaceus（Fisch.）Bge.var.mongholicus（Bge.）Hsiao或膜莢黃芪Astragalus membranaceus（Fisch.）Bge.的干燥根，含多糖、皂苷、黃酮、微量元素等多種化學(xué)成分，具有利尿、降壓、強(qiáng)心、提高機(jī)體免疫力和抗衰老等藥理作用。而側(cè)耳菌系擔(dān)子菌綱口蘑科側(cè)耳屬真菌，具有抗腫瘤、抗氧化、促進(jìn)免疫及降低膽固醇等多種藥理作用。二者在某些方面具有相似的功效，黃芪經(jīng)側(cè)耳菌發(fā)酵后得到的藥性菌質(zhì)的藥效可能會(huì)產(chǎn)生協(xié)同作用，比兩者單獨(dú)應(yīng)用或簡單相加的療效有所增強(qiáng)。微生物具有非常豐富的酶系統(tǒng)，有強(qiáng)大的分解、轉(zhuǎn)化物質(zhì)的能力。利用微生物發(fā)酵中藥，不僅可對(duì)中藥中的纖維、糖類、蛋白質(zhì)等加以利用，同時(shí)中藥中的一些成分可能誘導(dǎo)微生物的某些代謝途徑發(fā)生變化，從而產(chǎn)生新的化合物。而且微生物還可對(duì)中藥中的某些成分進(jìn)行轉(zhuǎn)化或修飾，產(chǎn)生新的化合物或引起中藥中一些成分含量的變化[1-2]，將為活性化合物的篩選提供豐富的資源。通過微生物的生長代謝和生命活動(dòng)來轉(zhuǎn)化中草藥,可以比一般的物理或化學(xué)的手段更大幅度地改變藥性,提高療效,降低毒副作用，擴(kuò)大適應(yīng)癥[3]。實(shí)驗(yàn)采用新型（雙向型）固體發(fā)酵技術(shù)[4]，選用藥食兩用真菌—側(cè)耳菌為發(fā)酵菌種，以中藥黃芪作為藥性基質(zhì)，進(jìn)行固體發(fā)酵，采用瓊脂糖凝膠電泳法對(duì)多糖成分進(jìn)行定性鑒別，并應(yīng)用蒽酮-硫酸法對(duì)其含量進(jìn)行定量測定，比較黃芪發(fā)酵前后多糖的變化，為新藥的研發(fā)提供了依據(jù)。

2010-10-25 *通訊聯(lián)系人

陳麗艷（1971-），女，碩士，副主任藥師，主要從事中藥新藥及保健食品的研究與開發(fā)工作。