紫外線和He-Ne激光誘變產植酸酶黑曲霉菌株的研究

張衛兵，郭愛蓮，甘伯中

（甘肅農業大學食品科學與工程學院，甘肅農業大學研究測試中心，甘肅省干酪素工程技術研究中心，甘肅蘭州730070）

紫外線和He-Ne激光誘變產植酸酶黑曲霉菌株的研究

張衛兵，郭愛蓮，甘伯中*

（甘肅農業大學食品科學與工程學院，甘肅農業大學研究測試中心，甘肅省干酪素工程技術研究中心，甘肅蘭州730070）

采用He-Ne激光(波長632nm,功率10mW)和紫外線對植酸酶產生菌黑曲霉Px的孢子和原生質體進行誘變。結果表明：原生質體對紫外線誘變的耐受能力比孢子強,而對He-Ne激光誘變的耐受能力比孢子弱。經誘變后篩選出一株突變菌株L2-2，植酸酶產量為9274 IU/mL，是出發菌株的1.51倍，傳代實驗表明該菌株植酸酶產量穩定。

植酸酶，He-Ne激光，原生質體，孢子

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黑曲霉（Aspergillus niger Px） 本實驗室篩選并保藏；菌絲生長培養基 蛋白胨0.3%，葡萄糖1.5%，MgSO4·7H2O 0.05%，MnSO4·7H2O 0.003%，FeSO4· 7H2O 0.003%，pH 5.5；斜面種子培養基 麩皮汁100mL，MgSO4·7H2O 0.05%，MnSO4·7H2O 0.003%，FeSO4·7H2O 0.003%，瓊脂1.5%～2%，pH5.5；再生培養基 酵母膏2%，葡萄糖4%，NaNO30.3%，KCl 1.05%，MgSO4·7H2O 0.05%，MnSO4·7H2O 0.003%，FeSO4· 7H2O 0.003%，KH2PO40.01%，pH6.0，上層含0.8%瓊脂，下層含2%瓊脂，用0.6mol/L NaCl溶液進行配制；固體篩選培養基 葡萄糖1.5%,植酸鈣0.1%，青霉素鈉200U/mL，MgSO4·7H2O 0.05%，MnSO4·7H2O 0.003%，FeSO4·7H2O 0.003%，瓊脂1.5%～2%，pH5.5；液體產酶培養基 蛋白胨0.3%，葡萄糖1.5%，MgSO4·7H2O 0.05%，MnSO4·7H2O 0.003%，FeSO4·7H2O 0.003%，pH5.5。

He-Ne激光發生器（波長632nm,功率10mW） 西北大學光電廠；高速冷凍離心機 日本HitachiR22G；恒溫水浴搖床 HZS-H型，哈爾濱東聯電子有限公司；高壓滅菌鍋 CRDX-280型，上海申安醫療機械廠；超凈工作臺 SW-CJ-1F型，蘇州蘇凈集團；生物顯微鏡 XS-18型，上海上光集團；三輥式壓榨機 TJ-305型，國營潮州市農機一廠；pH計 型號：PHS-3C，上海雷磁儀器有限公司；分析天平 型號：BS224S，德國塞多利斯公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 孢子懸液的制備 黑曲霉斜面用10mL無菌水洗下,玻璃珠振蕩0.5h，將上述孢子液3000r/min離心10min，棄上清液，然后用無菌生理鹽水將所得孢子洗滌2～3次，將孢子濃度調整為106個/mL左右待用。

1.2.2 孢子的紫外誘變 將制備黑曲霉孢子懸液調整到適當濃度，吸取9mL移入4個無菌培養皿中，用15W紫外燈照射，距離30cm，照射一定時間后涂布于固體篩選培養基上，30℃恒溫培養至長出菌落，接至液體產酶培養基中進行復篩,同時計算存活率和正變率。

1.2.3 孢子的激光誘變 將制備的黑曲霉孢子懸液調整到適當濃度，取0.2mL置于直徑0.5cm小試管，用He-Ne激光進行照射，輸出功率9mW，擴束光斑直徑2.5mm，照射距離30cm，照射不同的時間，涂布于固體篩選培養基上，30℃恒溫培養至長出菌落，接至液體產酶培養基中進行復篩,同時計算存活率和正變率。

1.2.4 原生質體的制備 將已培養好的菌絲置于離心管中，2000r/min離心15min，棄上清液。再用滲透壓穩定劑洗滌二次。稱量后，按300mg濕菌絲加1mL酶液，在一定溫度下酶解，間或振蕩，酶解時每隔0.5h取樣在顯微鏡下觀察，當大多數細胞形成原生質體時，停止酶解。將酶解液用滅菌的三層無菌擦鏡紙過濾后，4000r/min離心10min,收集原生質體，用滲透壓穩定劑洗滌和穩定，用血球計數板計數，得出原生質體的形成數。

1.2.5 原生質體的紫外誘變 將純化后的原生質體用高滲液稀釋至約105個/mL的懸液，用15W紫外燈照射，距離30cm，照射不同的時間后涂布于再生培養基平板上，30℃恒溫培養至長出菌落，在固體篩選培養基和液體產酶培養基上進行初篩和復篩,同時計算存活率和正變率。

1.2.6 原生質體的激光誘變[13]將純化后的原生質體用高滲液稀釋至約2.5×103個／mL，取0.2mL置于直徑0.5cm小試管，用He-Ne激光進行照射，輸出功率9mW，擴束光斑直徑2.5mm，照射距離30cm，照射不同的時間，涂布于再生培養基平板上，30℃恒溫培養至長出菌落，在液體產酶培養基中進行復篩，同時計算存活率和正變率。

1.2.7 復篩 將誘變后的菌株培養至孢子成熟后，接種3環于液體產酶培養基，30℃培養3d。四層紗布過濾，去除菌體，然后3000r/min離心10min，上清液為粗酶液，測其酶活，選出高產菌株。

1.2.8 突變株的遺傳穩定性 在連續傳代培養時，由于誘變株的性狀常常不穩定。為了檢測菌株性狀的穩定性，將誘變選出的植酸酶活力較高的菌株在種子培養基上連續傳代5次，檢測酶活力。通過分析，判斷傳代次數對酶活性變化影響是否顯著。

1.3 酶活測定方法[14]

取1mL粗酶液，加入2mL植酸鈉溶液（用pH為5.5的乙酸-乙酸鈉緩沖液配制，濃度為8.4g/L），并搖勻，37℃保溫反應30min，立即加入2mL顏色終止顯色液，終止并顯色，對照組先加入終止顯色液滅活后，再加入底物溶液，在415nm處測OD值，參照標準曲線計算酶活。

植酸酶酶活定義：按上述方法，在pH5.5的條件下，每分鐘從8.4g/mL的植酸鈉溶液中釋放1nmoL無機磷所需的酶量定義為一個活力單位（IU）。

1.4 數據處理

用統計分析軟件SPSS16.0對實驗數據進行分析。

2 結果與討論

2.1 紫外線對孢子的誘變

紫外線對黑曲霉孢子的誘變結果見表1。

表1 不同紫外處理時間對孢子的影響

由表1可以看出,隨著照射時間的延長,孢子的存活率逐漸下降,正變率則先增加再減少，在照射420s時正變率達到最高。綜合考慮兩方面因素，照射時間選擇420s較好。

2.2 紫外線對原生質體的誘變

紫外線對黑曲霉原生質體的誘變結果見表2。

表2 不同紫外處理時間對原生質體的影響

由表2可以看出，隨著照射時間的延長,孢子的存活率逐漸下降,正變率則先增加再減少，在照射60s時,正變率最高。比較表1和表2的結果,當用UV照射60s時,孢子的存活率為46%,而原生質體卻有50.9%，可見原生質體對紫外線的耐受能力比孢子強。原因可能是由于原生質體處在高滲溶液中接受照射，高滲溶液對它起了保護作用。另外在顯微鏡觀察中發現,原生質體易聚集成團,堆積成串和堆,可導致UV照射不均,這可能是原生質體對UV耐受能力強的原因之一,至于其它可能原因,如UV對其表面結構狀態的作用機制等有待進一步研究。

2.3 激光對孢子的誘變

采用激光對黑曲霉孢子照射不同時間，處理結果見表3。

表3 不同激光處理時間對孢子的影響

由表3可以看出，隨著照射時間的增加，孢子的死亡率逐漸增加，正變率也隨著增大，但增加到一定程度,正變率出現下降趨勢,可見并非致死率越高，其正變率越高，綜合考慮以15min照射劑量為最佳。

2.4 激光對原生質體的誘變

采用激光對黑曲霉原生質體照射不同時間，處理結果見表4。

表4 不同激光處理時間對原生質體的影響

由表4可以看出，隨著照射時間的增加，黑曲霉原生質的死亡率逐漸增加，正變率也隨著增大，但增加到一定程度，正變率出現下降趨勢,可見并非致死率越高，其正變率越高。另外對比表3、表4可以看出，在相同劑量下，原生質體的存活率遠遠小于孢子照射后的存活率，可見脫去細胞壁的原生質體比孢子對激光的反應更為敏感。正變率以照射8min時為最高，所以照射時間以8min為最佳，此時具有較高的致死率和較高的正變率。

2.5 突變株篩選結果

經紫外線和激光對原生質體和孢子分別進行多次誘變,從得到的突變株中篩選酶活較高的菌株，其中酶活較大的幾株見表5、表6。

表5 紫外誘變突變株的酶活

表6 激光誘變突變株的酶活

從表5可以看出，紫外誘變所選出的突變株中UV1-2、UV1-3植酸酶產量較高，兩株菌都是紫外線誘變孢子后篩選出的；激光誘變所選出的突變株中L2-2植酸酶產量最高，可達9274 IU/mL，為出發菌株的1.51倍，該菌株由原生質體經激光誘變后獲得。

2.6 突變株L2-2的遺傳穩定性

將所得L2-2菌株連續傳代5代，液體搖瓶發酵后測定植酸酶產量，實驗結果見表7，方差分析結果見表8。

由表7可以看出，不同代菌株植酸酶產量在9270～9275 IU/mL之間，可見該菌株的酶活變化不大。另外通過方差分析（表8）可知,其組間差異的P值遠遠大于0.05,說明傳代次數對酶活性變化影響不顯著,表明突變株L2-2具有穩定的遺傳性。

表7 不同代次的酶活

表8 傳代實驗的方差分析

3 結論

3.1 采用He-Ne激光和紫外線對植酸酶產生菌Px的孢子和原生質體進行多次誘變，選育出一株高產突變株L2-2,植酸酶產量為9274 IU/mL，是出發菌株的1.51倍。

3.2 原生質體對紫外線誘變的耐受能力比孢子強，而對He-Ne激光誘變的耐受能力比孢子弱。

3.3 對突變株L2-2進行傳代穩定性實驗，結果表明，經傳代后，突變株植酸酶產量穩定，遺傳性穩定性好。

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Mutation breeding of Aspergillus Niger with high phytase activity by ultra violet and He-Ne laser irradiation

ZHANG Wei-bing,GUO Ai-lian,GAN Bo-zhong*
（College of Food Science and Engineering,Gansu Agricultural University,Analysis and Research Center of Gansu Agricultural University,Gansu Casein Engineering Technical Research Center Lanzhou,Lanzhou 730070，China）

The protoplasts and spores of the origin strain Px were treated by laser and UV radiation to obtain strain with high phytase activity.Mutant L2-2 was obtained，whose phytase activity was 9274 IU/mL，as 1.51 times as the original strain.A good application and exploitation perspective of this strain was shown.

phytase；He-Ne laser；protoplasts；spore

TS201.2

A

1002-0306（2011）10-0228-03

植酸磷是在植物性飼料中以植酸鹽形式存在的有機磷化合物[1]。植酸磷的利用率因動物種類的不同而不同，反芻動物瘤胃中的微生物能產生植酸酶，因而植酸磷的利用率較高；非反芻動物因消化道缺乏植酸酶，因而植酸磷的利用率低[2]。植酸酶能催化飼料原料中的植酸及其鹽類水解成六磷酸肌醇和磷酸等可利用成分,因此能提高植酸磷的利用率[3]。石楊紅等報道，添加植酸酶可提高肉雞的全凈膛率、腿肌率和腹脂率等[4]。孟婕等研究了不同的植酸酶添加水平對艾維茵肉仔雞的生產性能、骨骼發育和健康狀況的影響，結果表明，植酸酶適宜添加量為500FTU/kg[5]。蔡景義等研究結果表明，菜籽粕和棉籽粕中植酸磷消化率與植酸酶的添加量呈極顯著二次曲線關系[6]。目前存在的阻礙植酸酶發酵生產和應用的因素主要有菌種的酶產量低、酶學性質不適宜等。要改變這一現狀，關鍵在于選育優良高效的植酸酶產生菌。在低功率激光中位于可見光范圍內的He-Ne激光是在微生物誘變選育時應用最廣泛的激光[7-8]。原生質體失去細胞壁的保護作用，對環境、誘變劑等更為敏感，因此采用原生質體作為誘變材料，效果往往較傳統方法更為理想[9-10]。前期本實驗室從自然界篩選出了產植酸酶菌株黑曲霉Px,并對該菌株產植酸酶的條件進行了研究[11-12]。本研究以黑曲霉Px為出發菌株,分別用He-Ne激光和紫外誘變原生質體和孢子,以篩選高產菌株。

2010-09-21 *通訊聯系人

張衛兵（1974-），男，副教授，博士研究生，研究方向：應用微生物。

甘肅省農業生物技術專項項目（GNSW-2006-14）；甘肅省科技重大專項項目（0702NKDA034）。