人源彈性蛋白酶基因真核載體構建及表達

王海峰，許文濤，蘇春元，邱芳萍，羅云波，谷新晰，田洪濤，黃昆侖，*

（1.長春工業大學化學與生命科學學院，吉林長春130012；2.中國農業大學食品科學與營養工程學院，北京100083）

人源彈性蛋白酶基因真核載體構建及表達

王海峰1，2，許文濤2，蘇春元2，邱芳萍2，羅云波2，谷新晰2，田洪濤2，黃昆侖2，*

（1.長春工業大學化學與生命科學學院，吉林長春130012；2.中國農業大學食品科學與營養工程學院，北京100083）

從人體腎臟組織中提取的總RNA中通過反轉錄PCR（RT-PCR）擴增得到了ELA2B基因，并將其克隆到pGEMT easy載體中。然后用限制性內切酶EcoRⅠ和Not I對重組質粒pGEM-T easy/ELA2B和畢赤酵母質粒pPIC9K進行雙酶切，并且通過PCR技術去除ELA2B的信號肽，成功構建了真核表達載體pPIC9K/ELA2B，并將其轉入畢赤酵母表達宿主GS115中。得到150株轉化子，經含不同濃度G418的YPD平板篩選獲得20株高拷貝轉化子。甲醇誘導表達后，發酵液上清經SDS-PAGE檢測，獲得了大小約為28ku的目的條帶。通過酪蛋白平板檢測發酵液上清，出現透明圈，初步證明獲得了有生物活性的彈性蛋白酶。

人源彈性蛋白酶，畢赤酵母，基因克隆，蛋白表達

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

人體腎臟組織 本實驗室保存；pGEM-T easy/ ELA2B 已構建的帶有ELA2B成熟肽基因重組質粒；大腸桿菌DH5α感受態 北京欣經科公司；克隆載體pGEM-T easy、T4連接酶 Promage公司；畢赤酵母表達質粒pPIC9K，畢赤酵母宿主GS115 美國Invitrogen公司，由本實驗室保存；所用限制性內切酶EcoRⅠ，NotⅠ，rTaq DNA聚合酶、引物 TaKaRa生物工程（大連）有限公司；RNase A、Tris-base、EDTA、XGal、IPTG Sigma公司；DNA Marker DL2000、DNA回收試劑盒 北京TIANGEN生化科技有限公司；所有其它化學試劑 均為國產分析純。

HQL150C恒溫搖床 中國科學院武漢科學儀器研究所；LRH-150B型生化培養箱 廣東省醫療器械廠；Biofuge pico臺式高速離心機 德國；WDP型微生物多用培養箱 山東大學；HH、S11-2電熱恒溫水浴鍋 北京長安科學儀器廠；D-9405B型水平搖床 北京六一儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 重組質粒DNA提取及引物設計及合成 參考《分子克隆》（第二版），采用小量堿法將通過反轉錄等方法構建好并轉入E.coli DH5α的pGEM-T easy/ ELA2B質粒提出。提取的質粒放入到-20℃冰箱保存。

根據已知的ELA2B基因結構，利用DNAMAN軟件設計去信號肽的PCR擴增引物，然后在上下游引物中分別引入EcoRⅠ和NotⅠ酶切位點，引物由上海生物工程有限公司合成。

1.2.2 PCR方法獲得不含信號肽的ELA2B基因序列 以重組的pGEM-T easy/ELA2B質粒為模板，用rTaq DNA聚合酶，利用合成的引物進行PCR擴增。PCR反應體系為：ddH2O 20.2μL，10×PCR buffer 3μL，dNTP（2.5mmol/L）2.4μL，引物（20pmol/μL）各1μL，模板（1μg/μL）1μL，rTaq DNA聚合酶（5U/μL）0.4μL，總體積30μL。PCR反應參數為：94℃預變性4min，然后進入循環；98℃變性10s，64℃復性30s，72℃延伸1min，經過25個循環后，72℃延伸10min結束反應。

1.2.3 重組質粒pGEM-T easy/ELA2B的構建、提取及酶切鑒定 用DNA膠回收試劑盒回收并純化PCR產物。將純化的ELA2B基因PCR產物分別與pGEMT easy載體4℃連接過夜。然后將10μL連接載體與100μL感受態細胞混合，冰浴30min后，42℃熱激90s，然后立即冰浴2min，加入800μL LB液體培養基，于37℃下200r/min離心1.5h，8000r/mim離心1min，沉淀用100μL LB液體培養基回溶。

將制備的轉化細胞涂布于LB-Amp的平板（加入X-Gal和IPTG）上，通過藍白斑篩選陽性克隆[12-14]。

挑取平板上的白色菌落，接種于加Ampr的LB液體培養基中培養，37℃，150r/mim振蕩培養12h。取1μL菌液進行PCR擴增驗證，其反應參數按照1.2.2。對菌液PCR陽性菌落提取質粒，具體操作步驟參見《分子克隆實驗指南》（第二版）。

對提取出來的質粒DNA用適當的限制性內切酶（EcoRⅠ和NotⅠ）酶切，在20μL的反應體系中進行，體系如下：DNA 5μL；10×K buffer 2μL；0.1%BSA 2μL；EcoR I 1μL；Not I 1μL；ddH2O 9μL，37℃，消化1～3h后，電泳觀察酶切片段的位置和大小，以判斷所鑒定的質粒是否有外源片段插入以及插入片段的大小。選出陽性質粒，命名為pGEM-T/ELA2B。

1.2.4 克隆片段DNA序列測定及ELA2B基因表達載體的構建 陽性克隆菌株質粒DNA由大連TAKARA公司進行克隆片段序列測定，利用DNAMAN對測序結果進行分析，并遞交Genbank進行Blast比對。

同時用EcoR I和Not I對重組質粒pGEM-T/ ELA2B和酵母分泌型表達質粒pPIC9K進行雙酶切，分別加入質粒pGEM-T/ELA2B、pPIC9k各7μL；10×H buffer 2μL；0.1%BSA 2μL；EcoR I 1μL；Not I 1μL；ddH2O 7μL，37℃消化3h后，取少量反應液進行凝膠電泳檢測。從凝膠上回收與PCR產物大小一致的DNA片段和pPIC9K片段。

將回收的pPIC9K載體片段5μL與ELA2B基因片段10μL按摩爾比為1∶（3～10）的比例混合，然后加入10×T4 DNA ligase buffer 2.5μL；T4 DNA ligase（350U/ μL）1μL；ddH2O 6.5μL，構成25μL體系于16℃連接反應過夜進行體外連接，如圖1所示，連接反應液轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞[15]，以pPIC9K空載體轉化DH5α感受態細胞作為對照。

圖1 彈性蛋白酶ELA2B基因重組大腸桿菌表達載體的構建

1.2.5 pPIC9K/ELA2B陽性克隆的篩選、鑒定及畢赤酵母的轉化 從含Ampr的LB轉化平板上挑選單菌落，采用菌落PCR挑選陽性克隆，為進一步鑒定重組子，對PCR檢測為陽性克隆的質粒進行酶切鑒定，陽性克隆質粒命名為pPIC9K/ELA2B。20μL酶切體系如下：質粒pPIC9K/ELA2B 7μL；10×H buffer 2μL；0.1% BSA 2μL；EcoR I 1μL；Not I 1μL；ddH2O 7μL，37℃消化3h后，取少量反應液進行凝膠電泳檢測。

對于通過PCR鑒定為陽性的菌落提取質粒，用Sac I酶切線性化重組質粒pPIC9K/ELA2B（37℃，2h），制備線性化DNA，然后通過凝膠回收純化線性DNA。

挑取GS115酵母單菌落，活化至OD600值達到1.3～1.5。將細胞培養物于4℃，6000r/min離心5min，用500mL的冰預冷的無菌水將菌體沉淀重懸；離心，用250mL的冰預冷無菌水將菌體沉淀重懸；離心，用20mL的冰預冷的1mol/L的山梨醇溶液將菌體沉淀重懸；離心，用1mL的冰預冷的1mol/L的山梨醇溶液將菌體沉淀重懸，制備感受態細胞。

然后將溶解在10μL TE溶液中10μg的線性化DNA，與80μL的感受態細胞混勻，轉至0.2cm冰預冷的電轉化杯（冰浴5min）中[16-17]電擊。電擊的參數：電壓1.5kV，電容25μF，電阻200Ω。電擊時間為5ms。

電擊完畢后，迅速加入1mL冰預冷的山梨醇溶液將菌體混勻，轉至1.5mL的EP管。分別將菌體懸液200μL涂布于MD平板上。將平板置于30℃培養，直至單個菌落出現。

1.2.6 重組子的PCR鑒定 挑取單菌落活化培養，然后提取基因組，使用特異性F/R引物進行PCR鑒定，反應體系為：ddH2O 20.2μL，10×PCR buffer 3μL，dNTP（2.5mM）2.4μL，引物（20pmol/μL）各1μL，模板（1μg/μL）1μL，Taq聚合酶（5U/μL）0.4μL，總體積30μL。PCR反應參數按照1.2.2。取10μL反應液進行1.0%TAE瓊脂糖凝膠電泳，根據擴增片段大小對比，判斷酵母染色體DNA中有無ELA2B目的基因片段的插入。

1.2.7 重組轉化子甲醇利用型的平板篩選及外源基因多拷貝整合轉化子篩選 將上述MD平板上的轉化子用無菌牙簽對應點種在MD和MM平板上，30℃培養2～4d，比較MD和MM平板上菌落生長狀況，判定甲醇利用表型。

然后利用0.25、0.50、1、2、4mg/mL濃度的G418篩選多拷貝的整合轉化子。

1.2.8 ELA2B基因在畢赤酵母GS115中的誘導表達將重組酵母凍存菌種接于YPD平板上活化，28℃培養2d至長出單菌落后，挑取活化的單菌落置于YPD培養基中，于28℃培養24h后接入到200mL BMGY液體培養基中，于30℃，250r/min搖床培養，直到其OD600在2.0～6.0之間后于6000r/min離心5min收集菌體，棄上清，用無菌超純水洗滌菌體1～2次。將菌體轉移至100mL BMMY誘導培養基中，30℃，200r/min搖床培養。每隔24h從BMMY培養基中取出1mL菌液，同時補加甲醇至終濃度為1%（v/v）。取出的菌液于8000r/min離心5min，取上清液[18-19]，存于4℃，用于檢測酶活及電泳。

1.2.9 發酵上清液中彈性蛋白酶活性檢測及蛋白質檢測 在酪蛋白瓊脂板上放置滅過菌的小濾紙片，加入10μL的發酵上清液，在30℃溫箱放置24h，觀察酪蛋白瓊脂板上是否有透明的降解圈形成[20-21]。分別取不同天數的發酵上清液來進行聚丙烯酰胺凝膠電泳觀察蛋白條帶情況。

2 結果與分析

2.1 彈性蛋白酶ELA2B基因克隆和分泌型重組酵母表達載體的構建和鑒定

首先利用EcoRⅠ和NotⅠ雙酶切pGEM-T easy/ ELA2B重組質粒（見圖2-A），從凝膠上回收約750bp的ELA2B基因片段和約9.3ku的載體片段，純化后經T4 DNA連接酶于16℃連接，并轉化感受態DH5α，挑選菌落，用特異性引物F/R進行菌落PCR檢測。然后對菌落PCR檢測結果較好的菌株提取質粒，用EcoR I和Not I對質粒進行雙酶切，酶切結果見圖2-B。由圖2可知，表達質粒完全酶切后出現兩條帶，一條為載體片段，長約9.3ku，另一條為目的基因，長約750bp，說明彈性蛋白酶ELA2B基因已插入重組酵母表達載體中。將酶切驗證正確的陽性克隆送交大連TaKaRa生物技術有限公司進行測序。測序結果發現，ELA2B基因開放閱讀框正確插入α-信號肽因子下游，說明彈性蛋白酶ELA2B基因的分泌型酵母表達載體已構建成功，命名為pPIC9K/ELA2B。

圖2 1%凝膠電泳驗證構建的ELA2B克隆和表達載體

2.2 pPIC9K/ELA2B電擊轉化畢赤酵母及酵母轉化子的篩選

圖3 電擊轉化結果

將重組表達質粒pPIC9K/ELA2B和pPIC9K質粒分別用限制性內切酶SacⅠ（位于5'AOX1區域內）線性化后，電擊轉化GS115酵母感受態細胞中，又因為酵母受體菌GS115為組氨酸營養缺陷型菌株（His-），而pPIC9K載體上雖有含組氨醇脫氫酶基因（HIS4），因此，只有pPIC9K載體整合到酵母染色體上，重組子才能在不含組氨酸的MD基本培養基上生長。所以將轉化的畢赤酵母涂于MD平板培養，長出來的就是將pPIC9K/ELA2B成功轉化到畢赤酵母的菌落。結果如圖3所示，共獲得150株轉化子。

2.3 酵母轉化子的甲醇利用表型篩選

重組表達質粒pPIC9K/ELA2B用SacⅠ限制性內切酶（位于5'AOX1區域內）線性化后，質粒DNA通過與GS115染色體間AOX1區段的5'同源區發生同源重組，導致外源基因插入到染色體AOX1區段上游，即發生單交換事件，獲得的表達盒包含PAOX l、外源基因ELA2B和HIS4，所以外源基因插入到酵母染色體中并且沒有破壞GS115染色體上的醇氧化酶基因AOX1。因此，陽性酵母重組子的表型為His+Mut+，即組氨酸利用野生型，并且能夠在以甲醇為唯一碳源的培養基上正常生長，非轉化子則不能生長。酵母轉化子在MD/MM平板上的生長情況如圖4所示，獲得的轉化子在MD、MM平板上均生長良好，表明獲得的重組子為快速利用甲醇型。

圖4 酵母轉化子Muts/Mut+表型的平板篩選

2.4 G418基因多拷貝整合子篩選

通過G418體內多拷貝整合子篩選，我們獲得了抗不同G418水平（1.0、2.0、4.0mg/mL）的重組酵母菌株，且隨G418濃度提高，所獲整合子的數量逐漸減少。并且大部分在濃度為2.0mg/mL的G418平板上生長很正常，可以推測轉化子普遍含有多拷貝，并且在G418濃度達到4.0mg/mL時仍有20株可以正常生長，如圖5所示，從中篩選出一株做后續實驗。

圖5 His+轉化子含G418的YPD平板上的篩選

2.5 酵母轉化子的PCR鑒定

隨機挑取轉化子，活化培養然后提取轉化子基因組，同時也提取用于對照的不含ELA2B基因的pPIC9K空載體的酵母轉化子的基因組，進行PCR反應，結果如圖6所示。3～10泳道為用特異性引物F/R擴增pPIC9K/ELA2B/GS115基因組，1為雙酶切驗證過的pPIC9k/ELA2B質粒（陽性），3為空載pPIC9K基因組（陰性），結果泳道1出現特異性條帶；泳道2為用特異性引物擴增pPIC9K-GS115，未見有條帶擴出；3～10泳道在約762bp處出現目的條帶，說明ELA2B基因已經整合到酵母染色體上。

圖6 酵母轉化子PCR檢測結果注：M：DL2000 marker；1：質粒PCR產物；2：pPIC9K/GS115質粒PCR產物；3～10：重組酵母菌株PCR產物。

2.6 酵母轉化子誘導表達及彈性蛋白酶活性檢測

在酪蛋白平板上放置滅過菌的小濾紙圓片，在其圓心用移液器加載10μL 1～5d的發酵液上清，置于30℃培養箱中觀察酪蛋白降解的情況。如圖7所示，隨著誘導天數的增加，彈性蛋白酶活性呈遞增趨勢，在發酵第4d達到最大值。對照中，未誘導和轉入空載體的酵母發酵液中均未見有透明圈。說明彈性蛋白ELA2B基因已經成功整合于宿主基因組中，并開始表達目的蛋白。

圖7 不同發酵天數上清彈性蛋白酶蛋白活性比較

圖8 重組畢赤酵母菌株不同天數誘導表達上清的SDS-PAGE注：M：小分子量蛋白marker；1：轉化pPIC9K空載體的酵母菌誘導4d的表達產物；2～5：菌株誘導1～4d蛋白表達量，分別為1、2、3、4d。

2.7 彈性蛋白酶SDS-PAGE電泳

對酵母轉化子進行甲醇誘導表達5d。每隔24h取其上清，8000r/min條件下離心5min后分離菌體和上清，取誘導后每天表達的發酵液上清直接進行SDSPAGE電泳，如圖8所示。通過與陰性對照菌株（含pPIC9K）比較，及DNAMAN軟件對蛋白大小的推測，確定目的條帶在28ku左右，與預測的彈性蛋白酶蛋白大小一致；并且由圖8可見，隨著誘導時間延長，彈性蛋白酶的表達量呈明顯的遞增趨勢。

3 討論

在這一重組過程中，首先利用RT-PCR克隆人源彈性蛋白酶基因，然后將彈性蛋白酶基因轉入到載體中，然后篩選陽性，提取DNA然后線性化通過電轉化轉入到畢赤酵母GS115中進行誘導表達。同時由于多拷貝轉化子在外源蛋白的表達中要比單拷貝的表達量要高，并且拷貝數越多對G418的抗性越強，因此本文分別采用0.25、0.5、1.0、2.0、4.0mg/mL的G418對轉化后的菌種進行篩選，結果發現1mg/mL以下的G418平板上所有轉化子均可以正常生長，2.0mg/mL濃度的平板上只有少數轉化子表現出了生長抑制現象，在高濃度的4mg/mL的G418平板上，絕大多數的轉化子被抑制，最終篩選出了20株含高拷貝的轉化子。

我們通過轉化子在MM和MD平板上生長情況確定了所得畢赤酵母工程菌株為甲醇利用型。因此利用含甲醇的BMGY培養基對重組酵母進行誘導，同時用未轉入pPIC9K/ELA2B的酵母進行誘導作為陰性對照，分別收集發酵液，進行電泳實驗，發現轉入pPIC9K/ELA2B重組酵母培養基上清中含有分子大小約為28ku的蛋白，而未轉入pPIC9K/ELA2B的酵母發酵液中未出現該大小的蛋白。這與我們預期的結果一致。

同時收集不同誘導天數的重組畢赤酵母發酵液，取其上清直接點于酪蛋白平板上檢測其活性，發現隨著誘導天數的增加（1～5d），彈性蛋白酶對酪蛋白水解產生的透明圈呈增大趨勢，在第4d達到穩定。當然影響外源基因在畢赤酵母中表達的因素很多，對于任何一種表達系統，最佳的表達條件不是固定的，不僅受表達系統的控制也受目的蛋白自身性質的影響。因此，獲得重組畢赤酵母菌株只是邁出了蛋白表達的第一步，也為研究人源彈性蛋白酶的酶學性質提供了實驗材料。后續還應對重組人源彈性蛋白酶的發酵條件進行優化，以取得最佳發酵效果。

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Construction and expression of eukaryotic vector of elastase gene in human

WANG Hai-feng1,2,XU Wen-tao2,SU Chun-yuan2,QIU Fang-ping2,LUO Yun-bo2,GU Xin-xi2, TIAN Hong-tao2,HUANG Kun-lun2,*
（1.School of Chemical&Life Science,Changchun University of Technology,Changchun 130012,China；2.College of Food Science and Nutrition Engineering,China Agricultural University,Beijing 100083,China）

The human ELA2B gene was cloned from total RNA which was extracted from kidney of human by reverse transcription polymerase chain reaction(RT-PCR)，then a recombinant plasmid pGEM-T easy／ELA2B was obtained.After the recombinant plasmid pGEM-T easy／ELA2B and pichia expression plasmid pPIC9K digesting with EcoRⅠand Not I，and removing the signal peptide of ELA2B by PCR，the recombinant eukaryotic expression plasmid pPIC9K/ELA2B were successfully constructed and transformed into pichia host GS115.101 transformants were selected on the MD agar plates，and 16 highly expression transformants were screened by YPD plates containing G418.After expression of recombinant elastase in shaking flask by methanol induction，it was found the size of recombinant elastase was approximately 28ku by SDS-PAGE analysis.The casein protein could be hydrolyzed by fermentation supernatant which initially indicated that the expression product had biological activity.

human elastase 2B；pichia；gene cloning；protein expression

Q789

A

1002-0306（2011）10-0215-05

彈性蛋白酶（Elastase）是一種以水解不溶性彈性硬蛋白（elastin）為特征的蛋白水解酶，并且不同來源的彈性蛋白酶都具有較廣泛的水解特性[1-2]，都具有極大的經濟和應用價值，主要用于醫藥、日用化學及食品等工業中[3-4]，它可由動物胰臟提取或由微生物發酵制得[5-6]。目前，彈性蛋白酶主要作為治療高脂血癥、防治動脈粥樣硬化癥的生化藥物[7]，療效確切，安全可靠。我國生產彈性蛋白酶主要由豬胰臟中提取，原料來源有限，且酶含量不高，每1kg鮮胰臟含彈性蛋白酶僅210000U，限制了生產的發展。微生物彈性蛋白酶與胰彈性蛋白酶一樣，不但能降解彈性蛋白，而且能分解酪蛋白、明膠、血纖維蛋白、血紅蛋白、白蛋白等多種蛋白質[8]。此外，藥用彈性蛋白酶既有通過動物胰臟提取，也有發酵生產得到的，其效果相似[9]。利用微生物發酵大規模工業化生產彈性蛋白酶不僅能提供足夠的治療用藥物酶，也能為開拓該酶其他方面的應用提供充足的酶源。針對于此，本研究運用反轉錄-聚合酶鏈反應（RT-PCR）技術，從人體腎臟組織提取的總RNA中擴增得到了ELA2B基因，并將其克隆到pGEM-T easy載體中。經菌落PCR鑒定、序列測定及序列分析得到正確的ELA2B基因序列，將人源彈性蛋白酶基因ELA2B轉入畢赤酵母[10-11]，利用畢赤酵母表達系統對其進行表達，使大規模生產安全的人源彈性蛋白酶成為可能，同時為人源彈性蛋白酶的結構和性質研究提供了實驗材料。

2010-12-20 *通訊聯系人

王海峰（1985-），男，碩士，研究方向：食品科學。

國家高技術研究發展計劃（863）項目（2006AA10Z440）；國家自然基金（30800770）；轉基因生物重大專項（2008ZX08012-001）。