不同條件下Camembert奶酪中無毒害李斯特菌空間生長分布

黃 微，劉 雪，劉少偉,﹡

（1.華東理工大學，上海200237；2.中國農業大學，北京100083）

不同條件下Camembert奶酪中無毒害李斯特菌空間生長分布

黃 微1，劉 雪2，劉少偉1,﹡

（1.華東理工大學，上海200237；2.中國農業大學，北京100083）

研究了在Camembert奶酪成熟過程中無毒害李斯特菌存活和生長的能力。用含有5lg CFU/mL無毒害李斯特菌的巴氏滅菌全脂牛奶精心制備Camembert奶酪。所有Camembert奶酪在以下三種情況下成熟：室溫（約20℃）和相對濕度60%（36h）；12℃、相對濕度93%（2周）；7℃、相對濕度85%（3周）。在成熟過程中，分別在1、5、10、15、20、25、30、35d時，利用選擇性培養基對奶酪表面和內部的無毒害李斯特菌進行計數。結果顯示，在成熟第1d時，無毒害李斯特菌數量為7.16lg CFU/g，比初始值的4.76lg CFU/g增加了2.40lg CFU/g；而在第20d時，無毒害李斯特菌數量降低至6.54lg CFU/g；在第35d時，李斯特菌數量增加至7.38lg CFU/g。總體而言，無毒害李斯特菌在奶酪表面的生長快于中心位置。

無毒害李斯特菌，Camembert奶酪，成熟，存活，生長

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

巴氏殺菌牛奶、培養基 市場購得；L.innocua、L.monocytogenes菌種保藏中心提供；酵母提取物 喝彩食品有限公司；大豆酪蛋白胨瓊脂培養基 上海振宇化工科技有限公司。

離心機Super T21 Sorvall 美國Newton公司；均質機bilon-08 上海比朗儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌種培養 將L.innocua保存在含0.6%的酵母提取物的胰酶解大豆酪蛋白胨瓊脂培養基斜面中，儲存在4℃下，每個月進行再次培養。接種前，使L.monocytogenes在150mL含0.6%的酵母提取物的大豆酪蛋白胨瓊脂溶液中于37℃下培養24h，然后在4℃下用離心機以3300×g離心25min。傾倒出上清液，將細胞再次放入150mL 0.1%的蛋白胨水中以獲得8lg CFU/mL的活性細胞群，接種到被污染的巴氏殺菌牛奶中。

1.2.2 Camembert奶酪的制備 本研究所有制備卡門貝爾奶酪的原料奶都經過巴氏殺菌，牛奶由超市購買，將24h菌齡的無害李斯特菌添加到牛奶中，使菌體含量達到之前所述的104～106CFU/mL。

1.2.3 制備奶酪所需的培養基和酶 奶酪制備用培養基從市場購買。培養基含有多種菌種：乳酸乳球菌乳酸亞種，乳酸乳球菌乳脂亞種，乳酸乳球菌乙酰乳酸亞種，明串珠菌乳脂亞種培養基儲存在-20℃的干燥環境中。

Pencillium candidum作為制備卡門貝爾奶酪的霉菌培養基。霉菌培養基也同樣儲存在-20℃的干燥環境中。先將600mg的霉菌培養基在1L的牛奶中溶解后，再加入到22L的牛奶中。

1.2.4 實驗室制備卡門貝爾奶酪 本實驗中卡門貝爾奶酪制備需重復一次。在使用前，將直接接觸牛奶，奶酪凝乳液和干酪的所有儀器（如大桶，刀具，模具紗布）及鹽水，都經高壓蒸汽滅菌以保證整個制備過程在無菌狀態下操作。卡門貝爾奶酪的制備步驟如表1所示[6]。

表1 卡門貝爾奶酪典型制備及成熟數據列表

1.2.5 無害李斯特菌的計數 每一批實驗，將三個含有無害李斯特菌的牛奶樣品（1mL）分別放入裝有20mL 0.1%無菌蛋白胨水中的100mL試管中。每塊接種無害李斯特菌的奶酪樣品放在400mL無菌振蕩均質機內，并添加20mL 0.1%無菌蛋白胨水。所有樣品在振蕩均質機里混合2min。經0.1%無菌蛋白胨水連續稀釋后，稀釋液通過MOX平板計數。所有平板在30℃下培養24h。最后，計數平板上由無害李斯特菌形成的典型菌落。

1.2.6 實驗設計 此實驗制備圓柱形卡門貝爾奶酪塊狀的大小（直徑108mm，高32mm），如圖1所示。

圖1 實驗室制備卡門貝爾奶酪典型奶酪塊大小

實驗用的奶酪塊狀的形狀和大小與市場上銷售的卡門貝爾奶酪一致。一次實驗平行制備三批奶酪（如圖2所示），三批奶酪均使用含有無害李斯特菌的牛奶制備，根據成熟過程中的測定次數的不同，每批制備8塊奶酪。為了驗證圓柱型奶酪的軸對稱性，將奶酪分割成120°的三個截面進行測量，成熟過程中分別對每塊奶酪三個截面的無害李斯特菌進行計數。每個截面分成五個不同的測量位置，如圖3所示。選擇這些測量位置主要根據以下幾分方面：a.根據Radhakrishnan[12]的初步測定結果，無害李斯特菌存活和生長有明顯的區域差異；b.無害李斯特菌存活和生長的空間分布的確定，對數學模型的建立有積極的作用；c.成本和時間的約束。

圖2 一批卡門貝爾奶酪實驗設計方案

圖3 測定無害李斯特菌存活和生長情況下樣品取點位置

卡門貝爾奶酪成熟4到5周后可進行食用[12]。基于這些考慮，本實驗關于無害李斯特菌存活和生長的實驗設計方案如表2所示。

表2 無害李斯特菌存活和生長實驗方案

1.2.7 統計分析 每次實驗的數據都由Minitab software（Minitab 13，Minitab Inc.，State College，PA）進行統計分析，所有統計分析的檢驗水平為0.05。根據一般線性模型對數值進行比較，取測得的細菌數與標準偏差值的平均值。

2 結果與討論

對三個批次的卡門貝爾奶酪成熟過程中的無害李斯特菌進行計數。其中每塊奶酪有三個截面，五個測量位置。

2.1 卡門貝爾奶酪制備中無害李斯特菌的存活情況

卡門貝爾奶酪由原料奶和巴氏殺菌牛奶制備。本實驗中所有的巴氏殺菌牛奶都接種經過24h培養的無害李斯特菌培養基。將1mL經過24h培養的菌體培養基添加到22L的巴氏殺菌牛奶后，牛奶中無害李斯特菌的細胞數大約保持在105CFU/mL。在制備卡門貝爾奶酪的過程中，因為起子培養基活性使pH下降，無害李斯特菌的生長得到抑制。但排出乳清后，無害李斯特菌在凝乳中得到了濃縮，結果導致干酪凝塊中無害李斯特菌數目升高到107CFU/g，如表3所示。

表3 奶酪制備過程中心上部（TC）無害李斯特菌菌落數情況（lg CFU/g）

2.2 卡門貝爾奶酪成熟過程中無害李斯特菌的存活情況

2.2.1 卡門貝爾奶酪成熟過程中無害李斯特菌存活的典型數據 成熟的前20d，所有奶酪塊中的無害李斯特菌總數逐漸減少，這主要是起子培養基活性降低了pH。第20d后，無害李斯特菌總數開始增長，這可能是由于奶酪中pH的升高[6]。Ramsaran等人[13]研究表明在卡門貝爾奶酪表面附近，因蛋白質水解釋放氨，pH較高，細胞存活性較高。圖4為TC處無害李斯特菌存活和生長趨勢。

圖4 卡門貝爾奶酪成熟過程中TC位置無害李斯特菌存活和生長情況

通過卡門貝爾奶酪成熟過程中物理、化學和微生物性質的變化可以幫助理解無害李斯特菌的生長情況。成熟35d后，pH趨于一個平穩分布，這歸因于霉菌獨特的空間生長情況，霉菌在奶酪表面比在內部能更好地存活和生長。因此，奶酪表面的pH比中心的要高。此外卡門貝爾奶酪成熟過程中還存在蛋白質水解和酸化代謝[6]。

Lenoir[5]發現奶酪的表面特征導致P.camemberti的快速生長和表面霉菌產生的蛋白酶擴散到奶酪里。由于起子培養基和P.camemberti反應后的蛋白質水解，蛋白質水解或蛋白質降解產生了含氨物質，導致低分子含氮化合物的形成[5]。隨著奶酪的成熟，在奶酪外皮和表面的氨濃度升高，這導致奶酪pH升高，同時乳酸代謝形成弱酸或其他化合物攜帶氫離子也會使pH升高。一般來說，低pH高溫可以導致病微生物高效失活。在前20d的成熟過程中，無害李斯特菌的生長受到低pH和高溫的影響。經過后15d的成熟，奶酪放在具有較低溫度的冰箱中培養。細菌有了一個較利于存活和生長的環境。但因為細菌不斷地恢復活性，細胞總數在第20d急劇下降。隨著菌體活性的完全恢復，無害李斯特菌群落在后續的成熟過程中繼續增加。

2.2.2 影響卡門貝爾奶酪成熟過程中無害李斯特菌數目的幾個因素

2.2.2.1 位置比較 每天成熟過程中，奶酪不同位置處菌體數有顯著性差異（P＜0.05）。圖5所示為5個菌數測定位置的菌體情況。

從測量數據可以看出，奶酪表面的菌落數（TS）高于奶酪中心的菌落數（見圖5），這可能是因為奶酪中心的pH低而表面pH迅速升高的關系。TC，BC和 BS位置由于這三個位置相似的pH，無害李斯特菌生長速率相似。總之，奶酪塊中細菌總數在前20d中下降1個對數數量級，在之后持續的成熟過程中升高1個對數數量級。因為pH低，奶酪中心位置的無害李斯特菌細胞生長率最低（C）。無害李斯特菌在中心上部位置（TC），中心下部位置（BC）和表面下部位置（BS）具有相似的生長速率，但TC處的無害李斯特菌菌落數比BC和BS位置的相對較高。這可能是因為在這些位置具有相似的pH[6]。總之，所有奶酪塊的菌落數在前20d成熟過程中下降，而后在20～35d成熟過程中升高。

圖5 卡門貝爾奶酪成熟過程中無害李斯特菌存活和生長情況

2.2.2.2 批次和截面比較 每天每批次和截面的數據沒有顯著性差異（P＞0.05）。換句話說，在奶酪塊中無害李斯特菌有相同的存活和生長趨勢。結果顯示，任何截面的測量都可代表奶酪塊的測量數據。

2.2.2.3 成熟時間比較 不同的成熟時間對菌體數目存在顯著性差異（P＜0.05）。制備后，因低pH李斯特菌細胞數稍有降低。第1d所有奶酪塊的細胞數平均值為7.16lg CFU/g。20d的成熟后降到了6.54lg CFU/g，隨后在35d成熟時間后升高到7.38lg CFU/g（如圖5所示）。無害李斯特菌在奶酪中不能生長的原因為pH較低，低pH降低了微生物的活菌數。在前20d的成熟過程中，奶酪中的pH低于5.5。在pH高于5.5時，無害李斯特菌菌數增加，這和之前報道過的文獻一致。

3 結論

3.1 由于細胞濃縮，凝乳比接種過的牛奶具有更高的細胞數目。接種過無害李斯特菌的牛奶有細菌4.76lg CFU/g，濃縮成凝乳后升高到7.16lg CFU/g。

3.2 前20d成熟過程中，因奶酪塊中的低pH，菌落數減少，其后在持續成熟過程中菌落數增加。

3.3 上表面區域（TS）具有較高的生長速率，然而，中心（C）區域生長速率較低。但是，中心頂部（TC），中心底部（BC）和表面底部（BS）區域具有相似的生長速率。

3.4 在批次和截面中無顯著性差異。但時間和位置對無害李斯特菌的存活和生長有顯著影響。

卡門貝爾奶酪成熟過程中無害李斯特菌存活和生長的數據可以建立一個動態預測模型。

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The spatial growth distribution of Listeria innocua under various conditions of Camembert cheese

HUANG Wei1,LIU Xue2,LIU Shao-wei1,*
（1.Eastern China University of Science and Technology,Shanghai 200237,China；2.China Agriculture University,Beijing 100083,China）

The ability of Listeria innocua to survive and grow during ripening of Camembert cheese was studied. Pasteurized whole milk containing about 5lg CFU/mL of L.innocua was used to elaborate in Camembert cheese.All cheeses were ripened in three stages:room temperature (about 20℃）and relative humidity 60% (36 hours)，12℃and relative humidity 93%(2 weeks)，7℃and relative humidity 85%(3 weeks).During ripening，surface and interior of cheeses were analyzed for population of L.innocua by surface plating on modified Oxford (MOX)agar.The data were collected on 1，5，10，15，20，25，30，35d during ripening.Results showed that population of L.innocua on the first day was around 7.16lg CFU/g which was 2.40lg CFU/g more than the initial inoculation of 4.76lg CFU/g.For subsequent 20 days，L.innocua population density declined to 6.54lg CFU/g. Thereafter，L.innocua population increased to 7.38lg CFU/g on 35d of ripening.Generally，the growth of L.innocua was faster in surface than in center location.

Listeria innocua；Camembert cheese；ripening；survival；growth

TS252.59

A

1002-0306（2011）10-0166-04

無毒害李斯特菌是一種革蘭氏陽性、不產生孢子、桿狀、嗜冷細菌、非溶血性及非致病的微生物[4]。兩種李斯特菌物種可在相同的自然環境下生長，通常可從巴氏滅菌牛奶、軟奶酪、日常產品和其他食品中分離出來。先前已有幾篇文章研究了無害李斯特菌（L.innocua）的存活和生長情況。Margolles等[9]報道了在阿斯圖里亞斯（西班牙北部）地區，可以從短期成熟的奶酪中分離出L.innocua品種。Greenwood等[3]研究指出在軟質牛奶奶酪中屢次發現L.innocua和L.monocytogenes（單增李斯特菌）。L.innocua已被成功作為評估熱處理過程對脫脂牛乳中L.monocytogenes的致死力的檢測[2]。目前，還沒有人研究在軟奶酪成熟過程中L.innocua的空間存活和生長情況。本文用類似于商業產品形狀的圓柱體Camembert奶酪來測量L.innocua的數量，此外，利用受污染的奶酪來測量L.innocua存活和生長的實際情況。因此，本文的研究目的一方面為測量Camembert奶酪在成熟過程中L.innocua存活和生長情況；另一方面評估和分析Camembert奶酪在成熟過程中L.innocua的空間分布狀態。

2010-09-03 *通訊聯系人

黃微（1986-），女，碩士，研究方向：低碳飲食。

上海市浦江人才計劃項目（09PJ1403700）；華東理工大學啟動項目（YF0142122）。