溶劑法純化還原型谷胱甘肽工藝的研究

徐麗萍，王 鑫，邢 超

(哈爾濱商業大學食品工程學院，省高校食品科學與工程重點實驗，黑龍江省哈爾濱150076)

溶劑法純化還原型谷胱甘肽工藝的研究

徐麗萍，王 鑫，邢 超

(哈爾濱商業大學食品工程學院，省高校食品科學與工程重點實驗，黑龍江省哈爾濱150076)

玉米胚中提取的還原型谷胱甘肽，除含有肽類物質外，還含有糖類、色素類、蛋白質類等水溶性物質，由于這些物質的存在，將使還原型谷胱甘肽的含量降低，并使其生理活性減弱，因此，為提高還原型谷胱甘肽化合物的純度，通過溶劑法對玉米胚中還原型谷胱甘肽粗提物進行純化工藝研究。選擇乙醇為溶劑沉淀法純化還原型谷胱甘肽最佳溶劑，通過單因素及正交實驗確定最佳工藝條件為:還原型谷胱甘肽粗提液與乙醇體積比為1∶1;乙醇濃度為100%;攪拌時間為15min。采用雙光束紫外分光光度法測定有機溶劑法純化玉米胚還原型谷胱甘肽的的得率為24.41%。通過紅外光譜測定純化后物質為還原型谷胱甘肽。

還原型谷胱甘肽，純化，乙醇

谷胱甘肽(Glutathione)是由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸通過肽鍵縮合而成的三肽化合物，化學名稱為N－(N－L－γ－谷氨酰－L－半胱氨酰)甘氨酸，其分子式為 C10H17O6SN3，屬于含有疏基的小分子活性肽［1］。谷胱甘肽廣泛分布于動物、植物、谷物和油料種子中，還原型谷光甘肽(GSH)廣泛存在于自然界、動物肝臟、酵母和植物胚芽中，其中玉米胚中GSH的含量約為112～126mg/100g［2］。人和動物的血液中也含有較多的GSH［3－4］，細胞中GSH的含量約為0.5～10mmol/L［5］，植物組織中GSH含量則較低。國內目前在GSH方面的研究處于起步階段，對純化的研究甚少，目前分離提純GSH的方法，見諸文獻報道的主要有:銅鹽法、雙水相法、樹脂法和有機溶劑法［6］。雖然利用以上幾種方法來生產GSH在實驗室均具有可行性，但是它們在工業化生產過程中卻還存在著許多問題，有些甚至無法實現工業化。目前，國際上日本等國家已經開始采用離子交換樹脂進行一些研究，并取得了很好的效果，國內關于離子交換樹脂分離GSH的研究已經逐步展開，但是不夠深入，故一直未能實現工業化。本文就進一步探討GSH的分離進行研究。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

還原型谷胱甘肽粗提物 實驗室自制;標準還原型谷胱甘肽 美國sigma公司;乙醇 天津市天新精細化工開發中心。

高速離心機TG16型 長沙英泰儀器有限責任公司;旋轉蒸發儀R－205型 上海申勝生物技術有限公司;真空干燥箱ZDF－6090型 上海恒一科學儀器有限公司;紫外可見分光光度計TU－1900型 北京普析通用儀器有限責任公司;紅外光譜儀 安捷倫科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 溶劑的選擇 根據GSH難溶于醇、丙酮等溶劑這一性質，采用溶劑沉淀法將GSH沉淀析出。分別采用乙醇、乙醚和丙酮對GSH進行純化，比較三種溶劑對GSH得率的影響，選擇最佳溶劑［7］。

1.2.2 溶劑沉淀法純化還原型谷胱甘肽的單因素選擇

1.2.2.1 GSH提取液與乙醇體積比的選擇 準確吸取GSH提取液10mL，分別按GSH提取液與乙醇體積比2∶1、1∶1、2∶3、1∶2、2∶5取90%乙醇5.0、10.0、15.0、20.0、25.0mL攪拌20min，離心后將沉淀物冷凍干燥，測定GSH得率。確定最佳體積比。

1.2.2.2 乙醇濃度的選擇 準確吸取GSH提取液10mL，加入10.0mL乙醇，分別采用乙醇濃度為60%、70%、80%、90%、100%攪拌20min，離心后將沉淀物冷凍干燥，測定GSH得率。確定最佳乙醇濃度。

1.2.2.3 攪拌時間的選擇 準確吸取 GSH提取液10mL，加入10.0mL乙醇，分別采用濃度為90%的乙醇攪拌5、10、15、20、25min，離心后將沉淀物冷凍干燥，測定GSH得率，確定最佳攪拌時間。

1.2.3 溶劑沉淀法純化還原型谷胱甘肽最佳工藝條件的確定 根據單因素實驗的結果，選擇影響純化效果的三個主要因素:GSH提取液與乙醇體積比(A)、乙醇濃度(B)、攪拌時間(C)，采用正交設計表L9(34)安排實驗。因素水平表見表1。

表1 因素與水平表

1.2.4 溶劑沉淀法制備還原型谷胱甘肽純化物 取10mL GSH提取液，加入10mL 90%乙醇，攪拌時間為20min。將沉淀冷凍干燥即得GSH純化物，并按下式計算產品得率:

式中:W－GSH得率(%);m－GSH純化物質量(g);M－GSH粗提物質量(g)。

1.2.5 還原型谷胱甘肽紅外光譜分析 分別將經干燥的 GSH1mg左右，與經干燥的 KBr粉末100～200mg在瑪瑙研缽中研細后壓片，在4000～400cm－1范圍內進行紅外光譜掃描。

2 結果與討論

2.1 溶劑的選擇結果

選擇乙醇、乙醚、丙酮在最優條件下進行溶劑沉淀法純化玉米胚中還原型谷胱甘肽，結果見表2。由表2可知，乙醇純化谷胱甘肽的得率較高。乙醚中含有微量水、乙醇和其他雜質，而丙酮常含有少量的水及甲醇、乙醛等還原性雜質，純化效果均沒有乙醇的好。并且乙醚和丙酮都是易揮發有毒有機溶劑，而乙醇作為一種常見有機溶劑，易揮發，對環境污染及危害小，是單一使用效果最好的有機溶劑，所以選擇乙醇做沉淀法溶劑。

表2 溶劑選擇結果

2.2 GSH提取液與乙醇體積比對純化的影響

GSH提取液與乙醇體積比為可變因素，其它兩個因素固定不變，即乙醇濃度為90%，攪拌時間為20min，考察GSH粗提液與乙醇體積比對純化效果的影響，其結果見圖1。

圖1 GSH提取液與乙醇體積比的選擇

從圖1中可知，當GSH提取液與乙醇體積比從2∶1至1∶1時，GSH得率有所增加;當二者比例小于1∶1后，GSH得率呈下降趨勢。由于體積比升高導致GSH濃度逐漸降低，可能是由于GSH在溶液中易氧化，使最終GSH得率較少。因此選擇體積比的最佳比例為1∶1。

2.3 乙醇濃度對純化的影響

乙醇濃度為可變因素，其它三個因素固定不變，即GSH提取液與乙醇體積比為1∶1，攪拌時間為20min，考察乙醇濃度對純化效果的影響，其結果如圖2所示。

圖2 乙醇濃度的選擇

從圖2中可知，乙醇濃度在60%～80%期間，GSH的得率上升明顯，乙醇濃度在80%～100%時的GSH得率趨于平穩，在90%時GSH得率取得最大值。由于GSH不溶于醇類物質，低濃度乙醇會溶解少量的GSH，純化不完全。因此選擇乙醇最佳濃度為90%。

2.4 攪拌時間對純化的影響

攪拌時間為可變因素，其它三個因素固定不變，即乙醇濃度為90%，GSH粗提液與乙醇體積比為1∶1，考察攪拌時間對純化效果的影響，其結果見圖3。

從圖3中可知，攪拌時間在5～15min時，GSH得率隨時間的延長而增大，超過15min后，曲線呈下降趨勢，下降緩慢。所以選擇最佳攪拌時間為15min。

2.5 溶劑沉淀法純化還原型谷胱甘肽最佳工藝條件的確定

通過正交實驗確定最佳的純化工藝，為了使實驗數據更加準確，每組實驗均做三次平行實驗，考察指標為GSH得率，其實驗結果見表3。

圖3 攪拌時間的選擇

表3 溶劑沉淀法純化GSH正交實驗結果

2.5.1 方差分析 由表4的極差分析可知，各因素對GSH提取率影響的大小順序為A＞C＞B，即GSH提取液與乙醇體積比＞攪拌時間＞乙醇濃度。最佳的因素水平組合為A2B3C1。即體積比1∶1、乙醇濃度100%、攪拌時間15min，GSH得率為24.41%。

表4 正交實驗方差分析表

2.6 紅外光譜檢測結果分析

圖4 標準GSH紅外掃描圖譜

由圖4～圖5和表5紅外光譜數據可以看出，純化后的物質顯示了特有的巰基、羧基、氨基、酮基等特征頻率，并且純化后的物質和標準品出峰位置均在振動頻率范圍內。GSH的特征基團為巰基，特征峰在2600～2500cm－1范圍內，標準GSH振動頻率位于2527.25cm－1，純化后物質移至2524.36cm－1，證明純化后的物質為GSH［8－10］。

圖5 純化樣品紅外掃描圖譜

表5 紅外光譜分析

3 結論

本研究選用三種有機溶劑進行純化實驗，結果表明乙醇純化效果最好。乙醇沉淀法純化GSH的最佳工藝條件為:GSH粗提液與乙醇體積比為1∶1，乙醇濃度為100%，攪拌時間為15min。純化后可將還原型谷胱甘肽的含量提高到24.41%。采用紅外光譜檢測，證明純化后物質和標準品還原型谷胱甘肽結構一致。確定純化后物質為還原型谷胱甘肽。

［1］沈亞領，李爽，遲莉麗.谷胱甘肽的應用與生產［J］.工業微生物，2000，30(2):41－45.

［2］宋增廷，姜寧，張愛忠，等.谷胱甘肽生物學功能的研究進展［J］.飼料研究，2008(9):25－27.

［3］Jones D P.Intracellular catalase function:Analysis of the catalytic activity by product formation in isolated liver cells［J］. Archives of Biochemistry and Biophysics，1982，214:806－814.

［4］劉振玉.谷胱甘肽的研究與應用［J］.生命的化學，1995，15 (1):19－20.

［5］劉曉穎，丁毅.豬血谷胱甘肽的提取與純化［J］.中國生化藥物雜志，1999，20(5):246－247.

［6］王淼，范崇東，蘇曉晉.陽離子交換法分離純化酵母細胞提取液中的谷胱甘肽［J］.食品科學，2007，28(4):211－217.

［7］許鐵成，王家騏，朱立江，等.有機溶劑純化谷胱甘肽方法初探［J］.發酵科技通訊，2008，37(3):13－15.

［8］陳儉梅，周林.幾種谷胱甘肽的檢測方法［J］.山東食品發酵，2007(3):26－29.

［9］Douglas C.實驗設計與分析［M］.北京:中國統計出版社，1998:589－592.

［10］袁志發，周靜芋.實驗設計與分析［M］.北京:高等教育出版社，2000:381.

Study on the purification process of reduced glutathione with the method of solvent

XU Li－ping，WANG Xin，XING Chao
(Key Laboratory of Food Science and Engineering，College of Food Engineering，Harbin University of Commerce，Harbin 150076，China)

The reduced glutathione contains carbohydrates，pigments，proteins and other water－soluble substances except peptides which was extracted from corn germ，the content of reduced glutathione will be reduced and the physical activity will be less because the presence of these substances，the extract of reduced glutathione was purified with the method of solvent from corn germ for improving the purity of glutathione compounds.Selecting ethanol as the best solvent of precipitation method，the optimum conditions of solvent precipitation method purified GSH by single factors and orthogonal experiments were determined as follows:GSH extract and ethanol of 1∶1 volume ratio，the ethanol concentration was 100%，stirring time was 15min.The content of reduced glutathione in corn germ was purified with the methods of solvent precipitation by dual－beam UV spectrophotometer，which was 24.41%.The material of extraction from the corn germ was reduced glutathione by IR.

GSH;purification;ethanol

TS201.1

B

1002－0306(2011)12－0348－03

2011－08－16

徐麗萍(1963－)，女，碩士，教授，研究方向:農產品加工與貯藏工程。

黑龍江省自然科學基金(C200813)。