巴斯德醋酸桿菌AC2005乙醇脫氫酶基因克隆與蛋白序列分析

張科平，鄭 宇，賈鈞輝，駱健美，王 敏

(工業發酵微生物教育部重點實驗室(天津科技大學)，天津科技大學生物工程學院，天津300457)

巴斯德醋酸桿菌AC2005乙醇脫氫酶基因克隆與蛋白序列分析

張科平，鄭 宇，賈鈞輝，駱健美，王 敏*

(工業發酵微生物教育部重點實驗室(天津科技大學)，天津科技大學生物工程學院，天津300457)

以具有優良醋酸發酵性能的巴斯德醋酸桿菌AC2005基因組DNA為模板，利用PCR的方法分別克隆了編碼乙醇脫氫酶亞基I和乙醇脫氫酶亞基 II的基因adhA和adhB。序列分析表明，adhA與 GenBank已報道的序列(accession number:D13893.1)具有94%的同源性，氨基酸序列同源性達98%;adhB與 GenBank已報道的序列(accession number:D13893.1)同源性為93%，氨基酸序列同源性達97%。利用TMHMM 2.0軟件，對乙醇脫氫酶跨膜結構進行了分析，發現乙醇脫氫酶亞基I和乙醇脫氫酶亞基II均為膜結合蛋白。利用Swiss－Model在線軟件模擬了巴斯德醋酸桿菌AC2005乙醇脫氫酶亞基I的三維立體結構。該研究對該酶的結構和功能的進一步分析提供了基礎。

巴斯德醋酸桿菌，乙醇脫氫酶，基因克隆，序列分析

醋酸是食醋的主要成分。醋酸發酵是利用醋酸菌(Acetic Acid Bacteria)完成從乙醇到醋酸的氧化反應，醋酸菌中含有多種乙醇氧化酶，其中結合于細胞膜上依賴 PQQ作為輔酶的乙醇脫氫酶(Alcohol Dehydrogenase，ADH)和乙醛脫氫酶 (Aldehyde Dehydrogenase，ALDH)是醋酸發酵過程中起主要作用的酶［1］。醋桿菌屬(Acetobacter)由于具有較強的乙醇氧化能力并且能夠在發酵過程中積累大量乙酸，而被廣泛應用于醋酸發酵中［2－4］。通過比較多株醋酸生產菌中乙醇脫氫酶的性質，發現定位于細胞膜上的乙醇脫氫酶的催化活性和其對高濃度醋酸的耐受性，對醋酸發酵和醋酸菌在高醋酸濃度條件下的生長非常重要［5］，并且乙醇脫氫酶的溫度穩定性也決定了醋酸菌在較高溫度下生長的能力［6］。不同的醋酸菌在不同的生長環境下，其乙醇脫氫酶的表達有很大的區別［7］，在醋酸菌中過量表達乙醇脫氫酶可以提高醋酸的生產速率和醋酸濃度［1］。本課題組在前期工作中篩選得到一株醋酸發酵菌株——巴斯德醋酸桿菌(Acetobacter pasteurianus)AC2005(中國普通微生物菌種保藏中心編號:CGMCC 3089)［8］。通過比較發現，巴斯德醋酸桿菌AC2005對酒精和醋酸的耐受性均優于目前工業上常用的醋酸生產菌株惡臭醋酸桿菌(Acetobacter rancens)AS1.41［8］。因此，本論文采用生物信息學的方法對巴斯德醋酸桿菌AC2005膜結合的乙醇脫氫酶進行研究，該研究將為今后對該酶的結構和功能分析提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

巴斯德醋酸桿菌(Acetobactorpasteurianus) AC2005 由本實驗室保存;大腸桿菌(Escherichia coli)DH5α感受態、Taq－DNA聚合酶、dNTPs、DNA分子量標準 北京全式金生物技術有限公司;T載體pJET 1.2 Fermentas公司;T4 DNA連接酶 Promega公司;限制性內切酶 寶生物工程(大連)有限公司;凝膠純化試劑盒(Column DNA back試劑盒) 北京天恩澤基因科技有限公司;引物合成及測序 由上海生工生物工程有限公司完成;其余試劑 為國產分析純。

PCR儀 德國BIOMETRA公司;全自動凝膠成像儀 美國Bio－Rad公司;電泳儀和電泳槽 北京六一儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 DNA和質粒的提取 DNA和質粒的提取方法按參考文獻［9］所述方法進行。

1.2.2 PCR擴增 根據GenBank報道的巴斯德醋酸桿菌乙醇脫氫酶亞基 I和亞基II的基因 adhA和adhB全序列設計PCR引物，為了便于重組克隆質粒的酶切鑒定，在引物中加入了酶切位點。

1.2.2.1 乙醇脫氫酶亞基I基因adhA的克隆 上游引物P1:5’－CGGGGTACCATGACCCGCCCCGCCTCCGCCAAGA－3’，下劃線為Kpn I酶切位點;下游引物P2:5’－ACGCGTCGACTTAGGGGTTAATGCCAAGTGTCG－3’，下劃線為Sal I酶切位點。

PCR反應體系:總 DNA模板2μL;引物 P1 (20μmol/L)0.5μL，P2(20μmol/L)0.5μL;dNTPs (2.5mmol/L each)5μL;5×buffer 10μL;FastPfu DNA聚合酶(2.5U/μL)0.5μL，加 ddH2O補足至50μL。PCR反應條件:95℃變性5min，95℃變性50s，50℃退火30s，72℃延伸150s，設置30個循環，最后72℃延伸10min使產物延伸完全。PCR產物4℃保存。

1.2.2.2 乙醇脫氫酶亞基II基因adhB的克隆 上游引物P3:5’－CGGGATCCGATGATGATGAACAGGCTAAAAACTGC－3’，下劃線為Bam HⅠ酶切位點;下游引物P4:5’－CCCAAGCTTTTACTGGGCTTCATCCACACCAGCA－3’，下劃線為HindⅢ酶切位點。

PCR反應體系:總 DNA模板2μL;引物 P3 (20μmol/L)0.5μL，P4(20μmol/L)0.5μL;dNTPs (2.5mM each)5μL;5×buffer 10μL;FastPfu DNA聚合酶(2.5U/μL)0.5μL，加ddH2O補足至50μL。PCR反應條件:96℃變性5min，96℃變性50s，55℃退火30s，72℃延伸80s，設置3個循環;96℃變性50s，57℃退火30s，72℃延伸80s，設置4個循環;96℃變性50s，59℃退火30s，72℃延伸80s，設置22個循環;總共設置30個循環，最后72℃延伸10min使產物延伸完全。PCR產物4℃保存。

1.2.3 擴增產物的克隆與測序 將純化后的目的條帶，分別與pJET 1.2克隆載體混合，16℃過夜進行連接反應。將連接產物轉入大腸桿菌DH5α，雙酶切篩選陽性重組質粒，并將鑒定正確的重組質粒pJET－adhA和pJET－adhB委托上海生工生物工程有限公司進行測序。

1.2.4 基因與蛋白序列分析 利用NCBI Blast軟件(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)進行序列同源性分析;TMHMM 2.0 軟 件 (http://www.cbs.dtu.dk/ services/TMHMM/)進行蛋白跨膜區域分析;Swiss－Model在線軟件(http://swissmodel.expasy.org/)進行蛋白三維立體結構預測。

2 結果與討論

2.1 乙醇脫氫酶亞基I和亞基II編碼基因——adhA和adhB的克隆

分別以巴斯德醋酸桿菌AC2005的基因組DNA為模板，用設計好的引物進行PCR擴增，PCR產物經1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果如圖1所示。結果表明，PCR擴增產物條帶單一，大小分別約2.2kb和1.4kb，與預期一致，說明PCR擴增結果正確，將回收的目的條帶分別命名為adhA和adhB。將回收的目的片段同T載體連接、轉化，將鑒定正確的陽性克隆子交由上海生工生物工程有限公司測序。

圖1 基因adhA和基因adhB的PCR產物

2.2 adhA和adhB的序列分析

根據測序結果，adhA基因和adhB基因全長分別為2229bp和1314bp，起始密碼子均為ATG，終止密碼子均為TAA，分別編碼724個氨基酸殘基和472個氨基酸殘基。

2.3 基因同源性分析

2.3.1 adhA序列同源性分析 將測序所得adhA序列與GenBank數據庫中的序列進行比對，發現與已公布的巴斯德醋酸桿菌乙醇脫氫酶亞基I基因(accession number:D13893.1)同源性最高，為94%，蛋白序列相似度達98%，說明所克隆序列為巴斯德醋酸桿菌乙醇脫氫酶亞基I基因。

2.3.2 adhB序列的同源性分析 將測序所得adhB序列與GenBank數據庫中的序列進行Blast，發現與已公布的巴斯德醋酸桿菌乙醇脫氫酶亞基Ⅱ基因(accession number:D13893.1)同源性最高，為93%，蛋白序列相似度達97%，說明所克隆序列為巴斯德醋酸桿菌乙醇脫氫酶亞基Ⅱ基因。

2.4 物理參數和跨膜螺旋及拓撲結構預測

2.4.1 乙醇脫氫酶亞基I的物理參數和跨膜螺旋及拓撲結構預測

2.4.1.1 物理參數分析 如表1所示。

表1 乙醇脫氫酶亞基I物理參數分析

2.4.1.2 跨膜螺旋及拓撲結構預測 利用TMHMM 2.0軟件，對乙醇脫氫酶亞基I進行跨膜分析。如圖2所示，從第1～20位氨基酸殘基位于細胞膜內，從2～43位和527～555位氨基酸殘基結合在細胞膜上，其余位氨基酸殘基位于細胞膜外。

圖2 乙醇脫氫酶亞基I的跨膜螺旋及拓撲結構預測

2.4.2 乙醇脫氫酶亞基Ⅱ的物理參數和跨膜螺旋及拓撲結構預測

2.4.2.1 物理參數分析 如表2所示。

表2 乙醇脫氫酶亞基II物理參數分析

2.4.2.2 跨膜螺旋及拓撲結構預測 利用TMHMM 2.0軟件，對乙醇脫氫酶亞基II進行跨膜分析。如圖3所示，第5～22位氨基酸殘基定位在細胞膜上，第23～473位氨基酸殘基位于細胞膜外。

2.5 三維立體結構預測

在Swiss－Model蛋白數據庫中對乙醇脫氫酶亞基Ⅰ蛋白序列進行分析，以同源性較高的假單胞菌中依賴PQQ作為輔酶的乙醇脫氫酶為模型，模擬出了乙醇脫氫酶亞基Ⅰ的三維立體結構，如圖4所示。

通過對克隆得到的巴斯德醋酸桿菌AC2005乙醇脫氫酶的基因序列分析表明，AC2005中的乙醇脫氫酶為膜結合蛋白，該酶是醋酸發酵過程中的關鍵酶。醋酸菌中膜結合乙醇脫氫酶的活性大小，影響乙醇氧化的速率和菌株對醋酸的耐受性，從而影響醋酸發酵的產物濃度［10－11］。乙醇脫氫酶的活性降低會導致菌體生長緩慢和醋酸發酵濃度降低［11］，而在醋酸菌中過量表達乙醇脫氫酶可以提高醋酸發酵的生產速率和產物濃度［1］。乙醇脫氫酶亞基I主要負責同底物乙醇和輔酶PQQ的結合，而亞基II主要負責乙醇脫氫酶在細胞膜上的定位和電子的傳遞［7］。因此，在今后的研究過程中可以重點研究定位于細胞膜外的氨基酸殘基序列對乙醇脫氫酶活性和醋酸生產的影響，即重點研究亞基I從43～527位氨基酸殘基序列和亞基II從第23～473位氨基酸殘基序列變化對乙醇脫氫酶活性的影響和醋酸發酵的影響。

圖3 乙醇脫氫酶亞基Ⅱ的跨膜螺旋及拓撲結構預測

圖4 乙醇脫氫酶亞基I三維立體結構預測

3 結論

本研究采用 PCR技術，從巴斯德醋酸桿菌AC2005基因組中成功克隆了分別編碼乙醇脫氫酶亞基Ⅰ和亞基II的adhA和adhB基因。利用生物信息學軟件分析表明，adhA和adhB所編碼的乙醇脫氫酶為膜結合蛋白。乙醇脫氫酶亞基I從第43～527位氨基酸殘基序列、亞基Ⅱ從第23～473位氨基酸殘基序列定位與細胞膜外，這些氨基酸殘基對乙醇脫氫酶的催化活性和電子傳遞起重要作用，該研究為進一步對該酶的結構和功能進行分析提供了參考。

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Cloning and protein sequence analysis of alcohol dehydrogenase of Acetobacter pasteurianus AC2005

ZHANG Ke－ping，ZHENG Yu，JIA Jun－hui，LUO Jian－mei，WANG Min*
(Key Laboratory of Industrial Fermentation Microbiology(Tianjin University of Science and Technology)，Ministry of Education，School of Biological Engineering，Tianjin University of Science and Technology，Tianjin 300457，China)

The genes，adhA and adhB，coding the subunit I and II of alcohol dehydrogenase(ADH)were amplified by the polymerase chain reaction(PCR)，using genomic DNA of Acetobacter pasteurianus AC2005 as template，which had been demonstrated a potential strain for acetic acid production.The sequences were blasted in GenBank databases.The results showed that adhA shared 94%identity and 98%amino acid sequence homology，besides adhB shared 93%identity and 97%amino acid sequence homology with the reported gene(accession number:D13893.1).The characterization of transbilayer helix of ADH was analyzed，using software of TMHMM 2.0.It was found that the subunits I and II were both membrane－bound protein.Furthermore，the three dimensional structure of subunit I of ADH in A.pasteurianus AC2005 was produced by using Swiss－Model workspace.Those results provided that some information for further researching the relationship of structure and function of ADH.

Acetobacter pasteurianus;alcohol dehydrogenase;gene clone;sequence analysis

Q789

A

1002－0306(2011)12－0265－04

2011－03－07 *通訊聯系人

張科平(1985－)，女，碩士研究生，研究方向:菌株特性及菌種改造方面的研究。

國家十一五科技支撐計劃子課題(2008BAI63B06);高等學校博士學科點專項科研基金(20101208120003);天津市科技攻關重點項目(06YFGZNC00400)。