雜色鮑組織蛋白酶L的分離純化與性質研究

董訓江，鐘 嬋，蔡秋鳳，曹敏杰

(集美大學生物工程學院，福建廈門361021)

雜色鮑組織蛋白酶L的分離純化與性質研究

董訓江，鐘 嬋，蔡秋鳳，曹敏杰*

(集美大學生物工程學院，福建廈門361021)

通過硫酸銨分級沉淀、SP-Sepharose陽離子交換層析、Sephacryl S-200 HR凝膠過濾和Hydroxyapatite羥基磷灰石層析，從雜色鮑(Haliotis diversicolor)內臟中分離純化了組織蛋白酶L。SDS-PAGE結果顯示，純化蛋白的分子量約為28ku。該酶最適溫度37℃，最適pH5.5。當溫度低于40℃，pH在5.0～6.5范圍內該酶較穩定。底物特異性實驗與抑制劑實驗結果表明，該酶屬于半胱氨酸蛋白酶。金屬離子Mn2+、Ba2+和Mg2+對該酶有不同程度的激活作用，而Co2+、Cu2+、Zn2+、Fe2+和Ca2+等對該酶起抑制作用。

雜色鮑，組織蛋白酶L，分離純化，性質研究

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

雜色鮑 購自福建省廈門市大嶝島養殖場，平均體重(28.0±2.0)g，新鮮的雜色鮑即殺取其內臟，立即使用或凍存于-80℃待用;SP-Sepharose Fast Flow、Sephacryl S-200 瑞典 Amersham Biosciences公司;羥基磷灰石預裝柱(CHT-ⅡCartridge) Bio-Rad公司;熒光底物Z-Phe-Arg-MCA、Z-Arg-Arg-MCA、Arg-MCA等 日本Peptide Institute公司;反式琥珀酸-亮氨酰胺-胍基丁酮(E-64) Amresco公司;Chymostatin、Leupeptin Roche公司;乙二醇二乙醚二胺四乙酸(EGTA)、乙二胺四乙酸(EDTA)、苯甲基磺酰氟(PMSF)、Benzamidine Sigma公司;標準蛋白 Fermentas公司;其它試劑 均為國產分析純。

Avanti JA-25大型高速冷凍離心機 美國Beckman公司;BioPhotometer紫外分光光度計 德國Eppendorf公司;FP-6200熒光分光光度計 日本Jasco公司;G∶BOX凝膠成像儀裝置 美國Syngene公司;組織搗碎機 瑞士Kinematica公司;WB-14恒溫水浴鍋 德國Memmert公司;蛋白質電泳裝置美國Bio-Rad公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 酶活力的測定 以Z-Phe-Arg-MCA為底物，參照Barrett［9］等人的方法，并略作修改：50μL酶液加入900μL含有1mmol/L EDTA和2mmol/L DTT的0.1mol/L乙酸鈉緩沖液(pH5.5)(緩沖液A)中，混合均勻后加入50μL 10μmol/L熒光底物，在37℃反應10min，立即加入1.5mL終止液(甲醇∶異丙醇∶水= 35∶30∶35，v/v/v)終止反應，用熒光分光光度計測定反應后釋放產物7-amino-4-methylcoumarin(AMC)的熒光強度，測定的激發波長為380nm，發射波長為450nm。

活力單位(U)定義為每min釋放1nmol AMC所需要的酶量。

1.2.2 蛋白質濃度測定 純化過程中，用紫外分光光度計測定在280nm波長下的吸光值轉化為蛋白質含量;純化蛋白的濃度采用Lowry法測定［10］，以牛血清白蛋白為標準蛋白。

1.2.3 酶的純化 鮑魚內臟(約120g)用剪刀剪切成小塊，加入冰冷的4倍體積50mmol/L乙酸鈉緩沖液(pH4.5)(緩沖液 B)，其中含 1mmol/L PMSF和1mmol/L EDTA，用組織搗碎機充分搗碎，于12000× g離心20min，取4層紗布過濾得上清液進行30%～80%硫酸銨分級沉淀。用少量的緩沖液B溶解沉淀后，在相同外液中透析除鹽。

將透析后的酶液上樣于事先用含0.2mol/L NaCl的緩沖液B平衡好的SP-Sepharose Fast Flow(2.6× 15cm)離子交換柱，用緩沖液B充分流洗去除未吸附的雜蛋白后，吸附部分的蛋白用含0.2～1.0mol/L NaCl鹽濃度的緩沖液B進行線性梯度洗脫，洗脫液的總體積為600mL，洗脫過程中每管收集5mL。對收集到的不同組分進行蛋白質測定和酶活力的檢測。收集活性峰部分，用YM-10超濾膜超濾濃縮。

將濃縮后的樣品上樣于用含有0.2mol/L NaCl的緩沖液B平衡好的Sephacryl S-200 HR凝膠過濾層析柱(1.5×98cm)，然后用相同的緩沖液流洗，每管收集2mL。對收集的不同組分進行A280和酶活力測定。收集活性部分并在5mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH6.5)(緩沖液C)中透析，其中含1mmol/L PMSF和1mmol/L EDTA。

將透析后的樣品上樣于用緩沖液C平衡的羥基磷灰石預裝柱(5mL)，充分流洗除去未吸附的雜蛋白。吸附部分的蛋白質用含 1mmol/L PMSF和1mmol/L EDTA的 5～200mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH6.5)進行線性梯度洗脫，洗脫總體積為80mL，洗脫時每管收集1mL。對收集到的不同組分進行蛋白含量和酶活力的檢測，同時對活性部分進行SDSPAGE凝膠電泳分析。

1.2.4 分子量的確定和純度鑒定 分子量測定采用Sephacryl S-200 HR凝膠過濾柱層析和SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)［11］相結合的方法;純度鑒定通過SDS-PAGE電泳圖譜和酶譜分析。

明膠酶譜：凝膠制備同SDS-PAGE凝膠制備，只是分離膠中用0.5mL的明膠溶液替換0.5mL蒸餾水。取一定量純化的酶液，加入SDS上樣緩沖液，直接上樣于12%的聚丙烯酰胺凝膠，于4℃下恒流(8mA)電泳。電泳結束后，凝膠移入體積分數為2.5% 的triton X-100中，置于搖床上搖動2×30min以去除SDS。倒掉triton X-100后用蒸餾水洗2～3次，然后將凝膠放入50 mmol/L乙酸鈉緩沖液(含1mmol/L EDTA，pH 4.5)中，在37℃恒溫水浴中孵育18～24h，取出凝膠，進行考馬斯亮藍染色，倒出考馬斯亮藍染色液后用脫色液緩慢搖動脫色，直至條帶清晰為止。

1.2.5 最適溫度和溫度穩定性 最適溫度的測定是將酶液放置在不同溫度(0～60℃)下進行酶活力測定，其它測定條件不變。

熱穩定性的測定是將酶液加入緩沖液A中，分別在10、20、30、40、50、60℃下放置30min后測定其剩余活性，確定酶的熱穩定性。

1.2.6 最適pH和pH穩定性 最適pH測定是將酶液放置在50mmol/L的不同pH緩沖液中進行酶活測定，其它測定條件不變;pH穩定性測定是將酶液放置在50mmol/L的不同pH緩沖液中4℃下孵育4h處理后，用1.2.1的方法在含有1mmol/L EDTA和2mmol/L DTT的緩沖液A中測定其剩余酶活力。

其中不同pH緩沖液為乙酸鈉緩沖液(pH3.0～5.5)和磷酸鹽緩沖液(pH6.0～7.0)。

1.2.7 底物特異性測定 以不同類型的熒光底物為目標分解物，酶活測定的其他條件不變，測定相應的酶活力。以Z-Phe-Arg-MCA熒光底物為對照。

1.2.8 蛋白酶抑制劑的作用 在緩沖液A中，將酶液與不同類型的蛋白酶抑制劑充分混合，并在室溫下放置30min后，測定酶的剩余活力。對照樣品的反應條件一致，但不添加任何抑制劑。

所用抑制劑有：E-64、Leupeptin、Chymostatin、PMSF、Benzamidine、EDTA、EGTA、Pepstatin。

1.2.9 金屬離子的作用 在緩沖液A中，將酶液與終濃度為1mmol/L的不同二價金屬離子溶液充分混合，室溫下放置30min后，測定剩余酶活力。對照樣品的反應條件一致，但不添加任何金屬離子。

表1 組織蛋白酶L的純化表

2 結果與分析

2.1 酶的分離純化

2.1.1 SP-Sepharose陽離子交換柱層析 雜色鮑內臟經過預處理和硫酸銨鹽析后，上樣于事先用含0.2mol/L NaCl的緩沖液A平衡的SP-Sepharose陽離子交換層析柱，結果如圖1所示。由圖1可見，SP-Sepharose陽離子交換柱層析可以有效地將雜蛋白與目的蛋白分開。經過酶活力的測定和SDSPAGE電泳圖譜分析，收集酶活性高但是雜蛋白相對少的組分(第 218～245管)，經超濾(Amicon，YM-10)濃縮后上樣于Sephacryl S-200 HR凝膠過濾柱層析。

圖1 SP-Sepharose陽離子交換柱層析

2.1.2 Sephacryl S-200 HR凝膠過濾柱層析 樣品經過Sephacryl S-200 HR凝膠過濾柱層析的結果如圖2所示。由圖2可知，除目的蛋白峰外還有其余多個蛋白峰，因此，認為樣品經過Sephacryl S-200 HR凝膠過濾柱層析后與大量雜蛋白分離，有利于目的蛋白的進一步純化。收集活性峰部分充分透析后，進行下一步羥基磷灰石柱層析。

圖2 Sephacryl S-200 HR凝膠過濾層析

2.1.3 羥基磷灰石柱層析 如圖3所示，樣品經過羥基磷灰石柱層析后酶活峰與蛋白峰基本重疊，表明組織蛋白酶L得到了高度純化。

經過硫酸銨鹽析、SP-Sepharose離子交換柱層析、Sephacryl S-200 HR凝膠過濾柱層析和羥基磷灰石柱層析等得到純度較高的組織蛋白酶L，結果如表1所示。純化倍數為1582.1，得率為13.4%，酶的比活力為3006U/mg。

圖3 羥基磷灰石層析

2.2 組織蛋白酶L的性質分析

2.2.1 分子量的確定和純度鑒定 SDS-PAGE電泳圖譜(圖4-A)和明膠酶譜(圖4-B)的結果顯示，純化的蛋白酶呈單一條帶，表明已達到電泳純。與標準蛋白相比，其分子量約為28ku。

圖4 鮑魚組織蛋白酶L的純化結果電泳圖注：A：SDS-PAGE;B：明膠酶譜;M：標準蛋白;泳道1：純化的組織蛋白酶L。

2.2.2 最適溫度及溫度穩定性 溫度對酶活力的影響如圖5所示。由圖5可知，組織蛋白酶L的最適溫度為37℃。在50℃時，組織蛋白酶L表現50%的活性，在10℃和0℃時，分別表現30%和19%的活性，說明該酶在低溫下的活性相對較低，但仍具有活性。

圖5 組織蛋白酶L的最適溫度以及熱穩定性

在30℃下放置30min后，酶的活力基本保持不變，而在40℃下放置30min后，酶活下降30%，而50℃下放置30min后，酶活基本喪失，因此，在低于40℃時，該酶的穩定性較好;而當溫度高于40℃時，該酶的熱穩定性較差。

2.2.3 最適pH及pH穩定性 如圖6所示，組織蛋白酶L的最適pH為5.5。pH低于4.0時，組織蛋白酶L的活性在50%以下;而在pH7.0時酶活基本全部喪失。由此可見，組織蛋白酶L是一種弱酸性蛋白酶，其在pH5.0～6.5范圍內活性較穩定。

表2 組織蛋白酶L的底物特異性

表3 蛋白酶抑止劑對組織蛋白酶L的作用效果

表4 金屬離子對組織蛋白酶L活性的影響

圖6 組織蛋白酶L的最適pH及pH穩定性

2.2.4 底物特異性 用不同的熒光底物來研究酶的底物特異性，結果如表2所示，該酶對組織蛋白酶L特異性底物Z-F-R有最強的分解能力，而對組織蛋白酶B的特異性底物Z-R-R、胰蛋白酶底物B-F-S -R、胰凝乳蛋白酶底物S-L-L-V-Y和氨肽酶底物Arg-MCA基本沒有分解作用。

2.2.5 蛋白酶抑制劑的作用 各種蛋白酶抑制劑對組織蛋白酶L活性的抑制效果如表3所示。半胱氨酸蛋白酶抑制劑E-64在0.01mmol/L時即可完全抑制該酶的活性;胰凝乳蛋白酶抑制劑Chymostatin和絲氨酸半胱氨酸蛋白酶抑制劑Leupeptin對該酶也有強烈的抑制作用;絲氨酸蛋白酶抑制(PMSF、Benzamidine)和天冬氨酸蛋白酶抑制劑(pepstatin)則不能有效地抑制其活性，而金屬螯合劑 EDTA和EGTA對組織蛋白酶L活性有一定的激活作用。結果表明，組織蛋白酶L為一種半胱氨酸蛋白酶。

2.2.6 金屬離子的作用 由表4可知，在濃度為1mmol/L時，金屬離子Mg2+、Ba2+和Mn2+有一定的激活作用，Fe2+和Ca2+能部分抑制酶活性，而Zn2+、Cu2+和Co2+能強烈抑制該酶的活性。

3 討論

通過一系列柱層析，從雜色鮑內臟中純化到了組織蛋白酶L。其分子量約為28ku，該結果與從鯉魚肝胰臟(28ku)［11］、大馬哈魚(30ku)［12］、箭齒鰈肌肉(27ku)［13］中純化的組織蛋白酶L的分子量相類似，但是與從一些魚體組織中純化的高分子量的組織蛋白酶L不同。有些組織蛋白酶L其分子量高達50ku，如日本鮐魚組織蛋白酶 L的分子量為65～69ku［14］，這種現象可能是組織蛋白酶L與其內源抑制劑結合成酶-抑制劑復合物的結果造成的。

底物特異性及抑制劑實驗表明，該酶對組織蛋白酶L底物Z-Phe-Arg-MCA有強烈的分解能力，而對組織蛋白酶B的特異性底物Z-Arg-Arg-MCA幾乎不分解，實驗結果表明，本研究純化的是組織蛋白酶L。

從溫度特性來看，純化的雜色鮑內臟組織蛋白酶L最適溫度為37℃，在低溫下活力較強，但熱穩定性較差。這與從其他動物組織中純化的組織蛋白酶L的最適溫度(50～60℃)不同，如鯉魚肝臟組織蛋白酶L的最適溫度為50℃［11］，箭齒鰈肌肉組織蛋白酶L最適溫度為60℃［13］。推測可能與鮑魚的生長環境有關，鮑魚在水溫7℃以下和水溫26℃以上幾乎不生長，生長最佳溫度范圍為15～20℃，在正常的棲息水溫(10～30℃)下有較強的活性以維持其生理活動。

從pH特性來看，雜色鮑組織蛋白酶L的最適pH為5.5，在pH5.0～6.5之間具有較好的穩定性，是一種弱酸性的酶，這與從其他組織中純化的組織蛋白酶L具有相似的結果。組織蛋白酶L作為一種溶酶體蛋白酶，具有很重要的生理功能。而這一功能的發揮，需要組織蛋白酶L的前體在溶酶體的酸性條件下自動水解，或在其它蛋白酶作用下水解去掉前體域，形成有活性的成熟的組織蛋白酶。由此可見，這種酶的pH穩定性與這種酶存在的環境所密切相關，對其生理功能的發揮也是很重要的。

組織蛋白酶L是極其重要的溶酶體型半胱氨酸蛋白內肽酶［15］。目前，人們普遍認為組織蛋白酶L對陸生動物的諸多蛋白有很強的水解活性［16］，也是導致魚糜凝膠劣化的重要酶類。本文對雜色鮑內臟組織蛋白酶L進行了分離純化，并對其酶學性質進行了初步研究，以期為今后深入研究組織蛋白酶L的生理功能奠定基礎，同時為鮑魚深加工提供一定的理論依據。

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Purification and characterization of cathepsin L from abalone(Haliotis Diversicolor)

DONG Xun-jiang，ZHONG Chan，CAI Qiu-feng，CAO Min-jie*
(College of Biological Engineering，Jimei University，Xiamen 361021，China)

Cathepsin L was purified from the hepatopancreas of abalone(Haliotis diversicolor)by ammonium sulfate fractionation，and chromatographies including SP-Sepharose，Sephacryl S-200 gel filtration and hydroxyapatite prepacked column.The molecular mass of the purified enzyme was estimated to be 28ku by SDS-PAGE.Optimum temperature and pH of the purified enzyme were 37℃and 5.5，respectively.The enzyme was stable in the range of pH from 5.0 to 6.5 and at temperature lower than 40℃.Substrate specificity and inhibitor sensitivity analysis revealed that the enzyme was a cysteine proteinase.A survey of effects of metal ions on the enzyme showed that metal ions including Mn2+，Ba2+and Mg2+activated the enzyme to some degree while Co2+，Cu2+，Zn2+，Fe2+and Ca2+revealed inhibitory effect.

Haliotis diversicolor;cathepsin L;purification;characterization

TS254.1

A

1002-0306(2011)12-0247-05

雜色鮑(Haliotis diversicolor)屬于軟體動物門，腹足綱，原始腹足目，鮑科，鮑屬。其足部肥大、肉質細嫩、營養豐富，具有較高的經濟價值和藥用價值，是我國南方沿海地區的主要養殖品種［1］。2010年，福建鮑魚產量突破3萬t，其中出口鮑魚產品約7500t，出口總額超過1億美元。養殖鮑魚產量的快速增長，鮑魚產品的大量出口，不僅為水產養殖戶帶來利益，也促進了福建省海洋經濟的快速發展。鮑魚在養殖過程中，常遇到病毒、細菌等微生物感染而引起的疾病以及嚴重時的大量死亡等問題，因此，提高鮑魚機體的自身免疫力尤為重要。組織蛋白酶L(EC 3.4.22.15)是半胱氨酸蛋白酶中木瓜蛋白酶C1家族的主要成員，廣泛存在于動物、植物、細菌和病毒等生物體內，在溶酶體內的蛋白水解過程中起重要作用［2］。組織蛋白酶L作為一種溶酶體蛋白不僅參與生物體內各種蛋白水解過程，還參與許多重要的生命活動［3］，如抗原呈遞［4］、寄生蟲感染［5］、骨質吸收、主要組織相容性復合體(Major histocompatibility complex，MHC)降解和細胞凋亡［6-8］等。因此，組織蛋白酶L與鮑魚的免疫力密切相關。在高等動物中，組織蛋白酶L由于參與機體多種生理、病理過程，備受學者的關注，但在貝類動物中對該酶的研究較少，特別是對鮑魚組織蛋白酶L的研究尚未見報道。鑒于此，本實驗從雜色鮑內臟中分離純化得到組織蛋白酶L，并研究其酶學性質，以期為探索組織蛋白酶L的生理學功能提供一定的理論依據，同時也可為鮑魚加工下腳料的回收利用提供新途徑。

2011-09-01 *通訊聯系人

董訓江(1982-)，男，碩士研究生，從事食品生物技術研究。

國家自然科學基金(31071519);福建省自然科學基金(2011J01227)。