褐藻寡糖分子量測定方法的研究

趙 珊，許加超，付曉婷，高 昕

(中國海洋大學食品學院，山東青島266003)

褐藻寡糖分子量測定方法的研究

趙 珊，許加超*，付曉婷，高 昕

(中國海洋大學食品學院，山東青島266003)

主要研究了快速、準確的褐藻寡糖分子量測定方法。通過高壓降解和氧化降解法制備出褐藻寡糖A和B，分別采用烏式黏度法和高效液相色譜法測定其分子量。結果顯示:烏式黏度法測得A和B的分子量分別是7300和5050;高效液相色譜法測得A、B的分子量分別是10666和7935。兩種方法測得的分子量趨勢關系基本相似，但是分子量數值相差較大。因為烏氏粘度計測量其特性粘度值，不能直接求出絕對平均分子量，是通過經驗公式計算所得;而在高效液相色譜法(HPLC)中，以分子量對數(lgMw)對保留時間(t)進行回歸處理，得到線性回歸方程:lgMw= -2.0338t+25.834，R2=0.9926，回歸關系較好。綜上所述，HPLC具有效率高，速度快，操作簡單，靈敏度高，分辨率高等特點，更適合分子量的測定，為褐藻寡糖分子量的測定提供了有利的科學依據。

褐藻寡糖，分子量，烏式黏度法，高效液相色譜法

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

褐藻酸 由青島黃海制藥股份有限公司晶巖生物科技提供;標準系列葡聚糖 中國計量科學研究院，分子量分別為 4320、12600、60600、110000、289000、521000g/mol。

手提式壓力蒸汽滅菌鍋(YXQG02) 山東新華醫療器械有限公司;高速離心機(TDL-5-A) 上海安亭科學儀器廠;烏氏粘度計 上海申誼玻璃制品有限公司;恒溫水槽(溫度波動不大于 ±0.05℃); Aglient1100高效液相色譜儀 美國安捷倫公司;TSK -GelGMPWXL色譜柱 日本Tosoh Bioscience公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 褐藻寡糖制備 將12g褐藻酸置于錐形瓶，加入150mL蒸餾水(pH約為2.43)，分為2份。A份不作處理，B份加入1%的H2O2。將兩份樣品分別放入高壓滅菌鍋中，在121℃高壓條件下降解2h。取出后加入2倍體積無水乙醇，沉淀完全后，滴加5mol/L NaOH，不斷攪拌調至pH8.5，并維持0.5h以上。將轉化好的褐藻寡糖置于離心杯中，5000r/min離心15min。離心后棄去上清液，將沉淀平攤于表面皿上，置于50～60℃干燥箱內4h，得褐藻寡糖A和褐藻寡糖B。

1.2.2 烏氏黏度法測定褐藻寡糖分子量

1.2.2.1 配制待測溶液 分別稱取105℃干燥6h的兩種褐藻寡糖0.5g，撒于約50mL的0.1mol/L NaCl溶液中(內含0.05%EDTA-2Na)，放置24h后溶解并稀釋至l00mL，待測。

1.2.2.2 特性粘數的測定 將上述溶液分別用G3砂型漏斗抽濾，棄去初濾液(約1mL)，取續濾液(不得少于7mL)，按照中國藥典烏式粘度法測定特性黏數［η］。

式中：T為待測液的流出時間，s;T＜［0］＞為溶劑的流出時間，s;η＜［r］＞為T/T＜［0］＞，100mL/g; c為供試液的濃度，g/mL［8］。

1.2.2.3 計算分子量 根據Mark-Houwink公式［η］=KMwα，根據文獻［11］，取K=2.0×10-5、α=1代入，計算兩種褐藻寡糖分子量。

1.2.3 高效液相色譜法測定褐藻寡糖分子量

1.2.3.1 色譜條件［12-13］色譜儀：Agilent 1100高效液相色譜儀(HPLC);色譜柱：TSK-gel GM PWxl色譜柱;檢測器：示差檢測器(RID);流動相：0.2mol/L NaCl(用0.45μm玻璃砂芯過濾裝置過濾并脫氣);流速：0.5mL/min;柱溫：40℃;進樣體積：20μL。

1.2.3.2 溶液的制備 將葡聚糖標準品分別溶于流動相中，使其終濃度為1g/L，振搖，室溫放置過夜，作為標準品溶液。

1.2.3.3 標準曲線的制備 用0.22μm微孔濾膜過濾，進行HPLC分析。記錄6種色譜圖，以峰位保留時間(t)為橫坐標，重均分子量的對數值(lgMw)為縱坐標進行線性回歸，得到標準曲線。

1.2.3.4 褐藻寡糖分子量的測定 將1.2.1制備的兩種褐藻寡糖溶于流動相中，使其終濃度為1g/L，振搖，室溫放置過夜，在“1.2.3.1”項的色譜條件下，進行HPLC分析，記錄峰位保留時間。根據待測樣品出峰時間以及標準曲線，計算樣品的分子量。

2 結果與討論

2.1 烏氏黏度法測定褐藻寡糖分子量

烏式黏度法測定的褐藻寡糖分子量結果見表1。

表1 烏式黏度法測定的褐藻寡糖分子量(n=3，t=(25±0.05)℃)

2.2 高效液相色譜法測定褐藻寡糖分子量

2.2.1 標準曲線的制作 將葡聚糖標準品依次進行HPLC分析后發現，圖譜均只出現一個吸收峰，峰寬較窄且峰形較好。分子量與保留時間對應關系，如表2所示。以標準品的分子量對數(lgMw)對保留時間(t)進行回歸處理，得到線性回歸方程：lgMw=-2.0338t+25.834，R2=0.9926，表明回歸關系較好，標準曲線如圖1所示。

表2 標準品分子量與保留時間的對應表

圖1 分子量標準曲線

2.2.2 褐藻寡糖分子量的測定 褐藻寡糖A、B的高效凝膠色譜圖，分別如圖2和圖3所示。

圖2表明，褐藻寡糖A的色譜圖峰寬較窄且峰形較好，分離效果較好，出峰時間為17.642min。

圖3表明，褐藻寡糖B的色譜圖峰寬較窄且峰形較好，分離效果較好，出峰時間為17.903min。

根據樣品保留時間及標準曲線，求出分子量，結果如表3所示。

圖2 褐藻寡糖A色譜圖

圖3 褐藻寡糖B色譜圖

表3 高效液相色譜法測定的褐藻寡糖分子量

結果表明，兩種方法測得的分子量趨勢關系基本相似，但是分子量數值相差較大，烏式黏度法測得的分子量小于高效液相色譜法測得的分子量。

3 結論

本文通過高壓降解和氧化降解的方法制備出褐藻寡糖。分別通過烏式黏度法和高效液相色譜法測定其分子量，結果表明兩種方法測得的分子量數量關系基本相似，但是分子量數值相差較大，烏式黏度法測得的分子量小于高效液相色譜法測得的分子量。對于測定方法而言，烏式粘度計實驗儀器易得，實驗條件簡單，操作簡便，但儀器的使用和清洗費時費力，而且用烏氏粘度計測量其特性粘度值，不能直接求出絕對平均分子量，而是間接地通過經驗公式計算，所以會帶來較大的誤差;另一種方法，HPLC法具有效率高，速度快，操作簡單，靈敏度高，分辨率高，樣品用量少，容易回收使用等優點，本文以分子量對數(lgMw)對保留時間(t)進行回歸處理，得到線性回歸方程：lgMw=-2.0338t+25.834，R2=0.9926，回歸關系較好。綜上所述，HPLC法更適合在分子量測定方面的廣泛應用。本文為褐藻寡糖分子量的測定工作提供了有利的科學依據。

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Study on the determination method of molecular weight of alginate oligosaccharide

ZHAO Shan，XU Jia-chao*，FU Xiao-ting，GAO Xin
(College of Food Science and Engineering，Ocean University of China，Qingdao 266003，China)

A rapid and accurate determination method of molecular weight of alginate oligosaccharide was studied. Alginate oligosaccharide A and B were degradated by oxidation and high pressure，and their molecular weight were determined respectively by ubbelohde viscometer and high performance liquid chromatography(HPLC).It was showed that，molecular weights of A and B were just 7300 and 5050，by ubbelohde viscometer，which were 10666 and 7935 however by HPLC.The molecular weights determined by two different methods coincided with each other but varied greatly.It was because that，the molecular weight determined by ubbelohde viscometer was calculated in empirical equation，not the absolute value;however，by HPLC，the linear regression equation was established between the log number of molecular weight(lgMw)and the retention time(t):lgMw=-2.0338t+ 25.834，R2=0.9926，which returned to a good relation.In summary，HPLC was precise，efficiency，smart and simple，which was more suitable for the determination，and provided a theoretical and empirical basis for the molecular weight determination of alginate oligosaccharide.

alginate oligosaccharide; molecular weight; ubbelohde viscometer; high performance liquid chromatography

TS207.3

A

1002-0306(2011)12-0486-03

褐藻酸鈉是由α-L-甘露糖醛酸(M單元)與β-D-古羅糖醛酸(G單元)的鈉鹽組成的多糖化合物，是海帶等褐藻類植物細胞壁結構多糖。褐藻酸鈉的質量要求未見中國藥典規定，褐藻酸鈉早在1938就已收入美國藥典，褐藻酸在1963年收入英國藥典。對于褐藻酸鈉的質量標準英國準藥典(BPO)和日本藥局方注解中雖已有規定，也無含量及分子量的規定，分子量的測定雖然不是藥典標準所必需，但對于進一步探討質量也是十分必要的。分子量參數是決定其使用性能的重要因素。褐藻酸鈉的分子量大小影響其各種性能，如流變性能、成膜性能、溶解性能等［1-2］。褐藻酸鈉屬于多糖，是天然高分子中具有多分散性的聚合物，用不同分子量測定方法測定的結果存在很大差異［3-4］。褐藻寡糖可以用很多方法進行制備，包括酸降解法、酶降解法和氧化降解法［5］。采用粘度、沉降平衡、膜滲透、凝膠色譜、光散射等方法測定褐藻酸鈉的分子量參數，最常用的決定分子量的方法是在粘性和光散射測定基礎上計算而得出的。褐藻酸鈉分子量的測定方法之一是烏氏粘度法。將褐藻酸鈉溶于一定的溶劑中，用烏氏粘度計測量其特性粘度值，根據特性粘度與分子量之間的關系公式計算出其粘均分子量，但該方法不能直接求出絕對平均分子量，而是間接地通過經驗公式計算，所以精確度較差［6］。高效液相色譜法(HPLC)是測定物質分子量的常用方法，該方法既可測定分子量的數值，還可反應分子量的分布情況，在國內外已得到廣泛應用［7-10］。但該法需采用標準樣品校準，由于市面上很難購得褐藻酸鈉分子量標準品，因此關于褐藻酸鈉的HPLC測定鮮有報道。本實驗通過高壓降解和氧化降解法制備出褐藻寡糖，分別采用烏式黏度法和高效液相色譜法測定其分子量，并對測定方法進行研究。

2010-10-14 *通訊聯系人

趙珊(1985-)，女，碩士，研究方向:海藻加工與利用。

海洋食品精深加工技術研究與產業化示范(2008BAD94B00)。