熒光假單胞菌PSEUDOMONAS FLUORESCENCE SK17.001轉化生產乳糖酸的條件研究

白會釵，張 于，江 波，沐萬孟，張 濤

(江南大學食品科學與技術國家重點實驗室，江蘇無錫214122)

熒光假單胞菌PSEUDOMONAS FLUORESCENCE SK17.001轉化生產乳糖酸的條件研究

白會釵，張 于，江 波*，沐萬孟，張 濤

(江南大學食品科學與技術國家重點實驗室，江蘇無錫214122)

利用熒光假單胞菌SK17.001為出發菌株，轉化乳糖生產乳糖酸。通過研究發酵條件和培養基成分對乳糖轉化率影響，表明熒光假單胞菌SK17.001的最適合轉化條件為:培養溫度30℃，pH 6.5，250mL搖瓶中液體培養基裝液量為30mL，搖床轉速為200r/min，最佳氮源為1%蛋白胨和1%酵母膏，培養時間55h，乳糖濃度為3%時，轉化率可達96%。

乳糖酸，熒光假單胞菌，生物轉化

1 材料與方法

1.1 材料與設備

Pseudomonas fluroscence SK17.001 本實驗室從土壤中篩選獲得，并鑒定;乳糖 購自Fluka公司;其他試劑 市售，均為分析純;斜面培養基 PDA;種子培養基(g/L) 蔗糖30，氯化鉀0.5，磷酸氫二鉀1，硫酸鎂0.2，硝酸鈉3，pH 6.2;發酵培養基(g/L) 乳糖30，蛋白胨10，酵母膏10，磷酸氫二鉀2，硫酸鎂1;底物濃度(g/L)30。

光照恒溫培養箱，高壓滅菌鍋，電子天平，722型分光光度計，HPLC。

1.2 培養方法

從斜面中取一定量熒光假單胞菌接種于種子培養基，28℃，200r/min，培養20h;從種子培養基接種至搖瓶發酵產酶培養基中，接種量為6%，250mL搖瓶裝液量30mL，溫度28℃，搖床轉速200r/min，振蕩培養，檢測乳糖酸的含量。

1.3 菌體生長濃度測定

采用722型分光光度計，在600nm下，測定菌液的OD值。

1.4 乳糖酸含量的測定

檢測乳糖酸的方法如下:取發酵液離心，上清液滅酶經微孔濾膜過濾(0.22μm)，濾液上HPLC分析。HPLC條件:Agilent1100色譜柱:Shodex SH1011 (8.0mm×300mm)，流動相為0.01mol/L H2SO4。檢測器:紫外檢測器，210nm，柱溫:50℃，流速:0.8mL/min，進樣量:10μL，乳糖酸標樣濃度:1%(w/v)。

乳糖酸濃度的計算方法:峰面積/1938×1%，

乳糖轉化率的計算方法:C(LA)/C總(Lac) ×100%。

2 結果與分析

2.1 發酵條件對乳糖酸產量的影響

2.1.1 熒 光 假 單 胞 菌 Pseudomonasfluroscence SK17.001的生長曲線 由圖1可知，0～8h為菌體生長的延滯期，11～23h為菌體生長的指數期，23h后菌體生長進入穩定期。

圖1 培養時間對菌體生長量的影響

2.1.2 發酵時間對熒光假單胞菌轉化乳糖酸的影響 由圖2可以看出，菌在對數生長期內，乳糖的轉化率極低;進入穩定期后，乳糖的轉化率增大，隨著時間的延長，轉化率增加的較少;40h乳糖的轉化率較高，55h乳糖的轉化率達到95%。

圖2 發酵時間對乳糖酸轉化率的影響

2.1.3 培養溫度對熒光假單胞菌轉化乳糖酸的影響

從圖3中可以看出，30℃時發酵液中乳糖酸的轉化率較高，說明30℃比較適合菌體生長和產酶，隨著溫度的升高，乳糖酸的轉化率急劇下降，在40～50℃時，乳糖酸轉化率極低。

圖3 溫度對乳糖酸轉化率的影響

2.1.4 pH變化對熒光假單胞菌轉化乳糖酸的影響

由圖4可知，當發酵培養基的pH為6.5時，發酵液中乳糖酸的轉化率較高，由此可以說明，發酵產乳糖酸的最適pH為6.5左右，而過酸和堿性條件均不適合產乳糖酸。

圖4 pH對乳糖酸轉化率的影響

2.1.5 搖瓶液體裝液量對乳糖轉化率的影響 固定發酵過程中搖床的轉速，通過改變搖瓶的裝載量，可以實現發酵過程中的不同通氣量，由此探討通氣量對乳糖酸轉化率的影響，結果見圖5。

圖5 裝液量對乳糖酸轉化率的影響

從圖5可以看出，裝液量越少，乳糖的轉化率越高，說明這種菌是一種需氧菌，在裝液量20～30mL之間，裝液量對底物轉化率的影響并不顯著。

2.1.6 接種量對乳糖轉化率的影響 接種量對發酵產乳糖酸的影響并不太明顯，在接種量為6%，即接種量為2mL左右時，乳糖的轉化率較高。

圖6 接種量對乳糖酸轉化率的影響

2.2 培養基成分對乳糖轉化率的影響

2.2.1 不同氮源對乳糖轉化率的影響 氮同碳一樣是構成微生物細胞結構和代謝產物中含氮物質的重要營養物質。在產酶培養基中，比較了幾種常見的無機氮和有機氮對乳糖酸轉化率的影響，結果如表1所示。

由表1可以看出，有機氮源蛋白胨和酵母膏比無機氮源適合菌體生長和乳糖酸的轉化。蛋白胨和酵母膏的成分復雜，在發酵過程中，很有可能既作為碳源，又作為氮源被微生物利用。

在用蛋白胨和酵母膏作為有機氮源的轉化培養基中，乳糖的轉化率最高。

2.2.2 添加不同碳源對乳糖酸產量的影響 碳是構成微生物細胞結構和代謝產物中碳骨架來源的重要營養物質。在轉化的基本培養基中，選取了幾種比較常見的單糖，考察其對乳糖轉化率的影響。

表1 不同氮源對乳糖轉化率的影響

在轉化培養基中，分別添加果糖和葡萄糖作為碳源，對乳糖的轉化率進行檢測，結果見表2。

表2 添加不同碳源對乳糖酸產量的影響

由表2可以看出，加入單糖后，乳糖的轉化率基本為零，說明單糖可作為優勢碳源被菌體利用，對乳糖的轉化產生阻遏。在培養基中加入葡萄糖或果糖后，菌體生長量增長很快，說明此菌也許不能利用乳糖作為碳源，而單糖是優勢碳源。

3 結論

本實驗用的熒光假單胞菌 Pseudomonas fluroscence SK17.001在發酵培養基中氧化乳糖生成乳糖酸。菌種生長到平臺期時，開始大量生成乳糖酸，表明轉化生成乳糖酸的過程不是菌種生長所必需的，乳糖酸是一種次級代謝產物。

熒光假單胞菌是一種高度需氧的原核細菌，可利用葡萄糖，果糖等單糖作為碳源，進入機體進行代謝。可將乳糖氧化為乳糖酸，卻不被微生物體所利用。

熒光假單胞菌Pseudomonas fluroscence SK17.001產乳糖酸的最佳培養條件為:培養溫度30℃，pH6.5，250mL搖瓶中液體培養基裝液量為30mL，搖床轉速為200r/min，最佳氮源為1%蛋白胨和1%酵母膏，乳糖濃度為3%時，培養時間55h，轉化率可達96%。

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Study on the conditions of lactobionic acid production from Pseudomonas fluorescence SK17.001

BAI Hui－chai，ZHANG Yu，JIANG Bo*，MU Wan－meng，ZHANG Tao
(State Key Laboratory of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China)

The strain of Pseudomonas fluorescence SK17.001 was used to convert lactose to lactobionic acid.The results were as follow:pH 6.5，30℃，with 30mL volume of liquid，1%peptone and 1%yeast extract，3%(w/v)lactose could be converted to lactobionic acid after 55h incubated，the ratio of conversion could reach to 96%.

lactobionic acid;Pseudomonas fluosecence;bioconversion

TS201.3

A

1002－0306(2011)12－0236－03

乳糖酸(lactobionic acid)是集抗老、保濕、抗氧化和促進機體更新等多種功效于一身的第三代果酸，本身存在于機體中，無刺激性問題。乳糖酸和金屬螯合能夠降低由于離子催化生產的氫氧基對組織的損傷［1］，因此可用在器官移植緩沖液中［2－3］，防止器官受到自由基的傷害;乳糖酸可促進大環內酯類抗生素的溶解性，如紅霉素的乳糖酸水溶液的溶解性比紅霉素高出50～100倍［4］;乳糖酸鈣的溶解性較高，可用來補充鈣的吸收，也可用來做葡萄糖酸鈣的過飽和溶液［5］。乳糖酸可以降低酸味，減少成熟時間［6］，促進礦物質鹽的吸收，不增加氧化的風味和氣味［7－9］。乳糖酸還可用來降解生物物質，作為洗滌劑的成分［10］。乳糖酸具有最佳的保水性，可抗氧化，抗衰老，是化妝品中的主要組分。目前制備乳糖酸的方法有化學催化合成法［11］以及生物轉化法［12］。化學合成法會產生多種副產物和化學污染物，使得分離、純化步驟變得復雜。微生物轉化法生產乳糖酸具有高效、低成本、轉化率高、副產物少等優點［13－14］，因此近年來研究人員都在探索用生物轉化的方法來制備乳糖酸。本實驗采用的熒光假單胞菌(Pseudomonas fluroscence SK17.001)是從土壤中篩選到的，保藏于典型培養物保藏中心，保藏編號為CCTCC M 2010216。以乳糖為轉化底物，添加碳源、氮源及無機鹽組成發酵培養基。本實驗對其轉化條件和培養基組分對乳糖酸轉化率的影響進行了研究。

2010－10－21 *通訊聯系人

白會釵(1982－)，女，在讀博士，研究方向:食品生物技術。