臘魚產香酵母菌的篩選及其發酵產香特性初步研究

梁 慧，馬海霞，李來好，*

(1.中國水產科學研究院南海水產研究所，國家水產品加工技術研發中心，農業部華南水產品加工與質量安全研究中心，廣東廣州510300;2.上海海洋大學食品學院，上海201306)

臘魚產香酵母菌的篩選及其發酵產香特性初步研究

梁 慧1，2，馬海霞1，李來好1，*

(1.中國水產科學研究院南海水產研究所，國家水產品加工技術研發中心，農業部華南水產品加工與質量安全研究中心，廣東廣州510300;2.上海海洋大學食品學院，上海201306)

從傳統臘魚中分離篩選得到了兩株產香酵母。結合形態學和酵母菌26S rDNAD1/D2區序列分析，初步鑒定一株為季也蒙畢赤酵母(Pichia guilliermondii，H9)，另一株為近平滑假絲酵母(Candida parapsilosis，J11)。采用固相微萃取(SPME)和氣質聯用(GC-MS)技術分析兩株酵母麥芽汁發酵液的揮發性成分。結果表明，兩株酵母的麥芽汁發酵液中的揮發性成分主要為醇類和酯類，但種類和組成差異較大。最后，對兩株酵母進行耐鹽性、亞硝酸鹽耐受性、耐酸性等發酵適應性實驗。結果表明，近平滑假絲酵母的發酵適應性強于季也蒙畢赤酵母，有望將其開發成為新型肉品發酵劑。

臘魚，產香，酵母菌，26S rDNA，發酵特性

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

臘魚 湖北荊州自制臘魚;麥芽汁瓊脂培養基、麥芽汁液體培養基、馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基 廣東環凱微生物科技有限公司;YEPD液體培養基配方酵母粉 10g，蛋白胨 20g，葡萄糖 20g，蒸餾水1000mL，pH 6.0，115℃濕熱滅菌20min;麥氏培養基葡萄糖1.0g，KCl 1.8g，酵母粉2.5g，醋酸鈉8.2g，瓊脂15g，蒸餾水 1000mL，121℃濕熱滅菌 20min; Biospin真菌基因組提取試劑盒 杭州博日科技有限公司;破壁酶 廣州東盛生物科技有限公司;山梨醇緩沖液 廣州東盛生物科技有限公司;PCR master mix 2× Fermentas;瓊脂糖 西班牙 Biowest;NaCl (分析純)。

明鑒SPX型智能生化培養箱 寧波江南儀器廠;全自動高壓蒸汽滅菌鍋 日本YAMATO公司;超凈工作臺 蘇州凈化設備有限公司;冷凍離心機Sigma;Eppendorf梯度 PCR儀 德國艾本德公司; Tanon1600型全自動數碼凝膠圖像處理系統 上海天能科技有限公司;紫外-可見分光光度計Spectronic genesysTM5 賽默飛世爾科技公司;手動SPME進樣器、15mL進樣瓶、65μmPDMS/DVB纖維萃取頭 美國Supleco公司;島津GC-MS 2010plus日本Shimadzu公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 酵母菌分離純化 無菌條件下稱取25g剪碎魚肉置于225mL生理鹽水中，充分振蕩，菌懸液經適當稀釋后涂布在麥芽汁瓊脂平板上，28℃培養3d。選擇具有典型酵母菌菌落特征的單菌落進一步劃線分離純化，直至得到純菌株。

1.2.2 產香酵母菌的篩選 將分離純化得到的菌株分別接入麥芽汁液體培養基中，于28℃搖床培養1d，28℃靜置培養2d。感官評定篩選出發酵液產生醇香、酯香的菌株。

1.2.3 酵母菌耐鹽性 以2%的接種量將酵母菌接種于氯化鈉含量分別為0、2%、4%、6%、8%、10%的YEPD液體培養基中，28℃搖床培養24h，于600nm處測定OD值。

1.2.4 酵母菌亞硝酸鹽耐受性 以2%的接種量將酵母菌接種于亞硝酸鹽含量分別為0、5、100、150mg/kg的YEPD液體培養基中，28℃搖床培養 24h，于600nm處測定OD值。

1.2.5 酵母菌耐酸性 以2%的接種量接種酵母菌于用乳酸調節pH為4.0、5.0、6.0和7.0的YEPD液體培養基中，28℃搖床培養24h，于600nm處測OD值。

1.2.6 酵母的形態培養特征觀察 固體培養特征觀察：將分離純化后的酵母菌株涂布到麥芽汁瓊脂培養基平板上，28℃培養72h，觀察菌落大小、色澤、表面形態、邊緣情況等特征。液體培養特征觀察：將分離純化后的酵母接種于麥芽汁液體培養基中，28℃培養72h后觀察有無醭以及有無沉淀物。在油鏡下觀察酵母的菌體形態及出芽方式，同時觀察酵母菌的子囊孢子、擲孢子和假菌絲產生情況［8-9］。

1.2.7 產香酵母菌的鑒定 按照Biospin真菌基因組DNA提取試劑盒的方法提取酵母菌的DNA，根據KURTZMAN等［10］的方法擴增分離菌株26S rDNA的D1/D2區域，引物為NL1(5’-GCA TAT CAA TAA GCG GAG GAA AAG-3’)和NL4(5’-GGT CCG TGT TTC AAG ACG G-3’)，由上海英駿生物技術有限公司合成。PCR反應體系(25μL)：PCR master mix 2× (Fermentas)12.5μL，引物 NL1/NL4(10μmol/L)各1μL，模板DNA 2μL。PCR擴增條件：95℃預變性5min，94℃變性40s，55℃退火40s，72℃延伸30s，40個循環后，72℃延伸10min。PCR產物由華大基因測序完成。應用BLAST程序，將所獲得的26S rDNAD1/D2區序列與NCBI-GenBank數據庫中已知酵母菌相應序列進行同源性分析，以確定菌種歸屬。

1.2.8 SPME法提取發酵液中的揮發性風味物質取菌株麥芽汁液體培養基發酵液(28℃搖床培養1d，28℃靜置培養2d)8mL置于15mL的樣品瓶內，加入2g NaCl加蓋封口，將樣品瓶置于50℃平衡10min，用固相微萃取手柄將探頭插入萃取瓶中，退出探頭，使探頭置于樣品瓶的頂空部分(分析前萃取頭在GC進樣口處250℃解析5min)，于50℃的磁力攪拌器上1000r/min萃取30min，萃取完成后在進樣口解析7min［11-12］，用于氣相色譜檢測酵母菌麥芽汁液體培養基發酵液揮發性風味成分。

1.2.9 菌株發酵液揮發性風味成分GC/MS分析條件 色譜條件：DB-5MS型色譜柱(30m×0.25mm× 0.25μm)。不分流進樣;進樣口溫度250℃;升溫程序：35℃，保留 2min，以 1℃/min升到 65℃，再以6℃/min升到220℃，保持3min;載氣為高純氦氣，流速為1mL/min。質譜條件：電離方式為EI，電離電壓70eV;離子源溫度為230℃;掃描范圍33～450m/z，掃描方式為scan。

各組分經過計算機NIST05.LIB譜庫檢索并與相關文獻比較，報道匹配度最大的結果，并通過面積歸一化法計算揮發性成分的相對百分含量。

2 結果與分析

2.1 兩株產香酵母的培養特征觀察

分離得到兩株產香酵母菌H9和J11，發酵液的感官香氣分別為醇香和酯香，其培養特征如表1所示。

表2 分離酵母菌株26S rDNA序列相似性分析

表1 酵母菌的菌落及菌體形態和液體培養特征

2.2 兩株產香酵母分離株的PCR結果

以NL1和NL4為引物對篩選所得的菌株DNA進行酵母菌特異性PCR擴增得到26S rDNA中D1/ D2區域序列，PCR擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測片段長度均為600bp左右，且無明顯非特異性條帶，如圖1所示。

圖1 酵母H9和J11PCR產物瓊脂糖凝膠電泳圖

2.3 26S rDNA序列分析

經測定，H9和 J11兩株產香酵母菌 26S rDNAD1/D2區序列擴增片段長度分別為595bp和617bp，將兩組序列應用 BLAST程序與 NCBIGenBank數據庫中的已知酵母菌序列進行相似性比較分析，結果發現，菌株H9的26S rDNAD1/D2區序列與 GenBank數據庫中 Meyerozyma guilliermondii (Pichia guilliermondiiATCC 6260)登 錄 號 為AAFM01000051的序列相比，僅有2bp的差異，同源性達到99.66%;菌株 J11與Gen-Bank數據庫中Candida parapsilosis CDC317 登 錄 號 為CABE01000013的序列相比，除多了3個核苷酸，還有10bp的差異，同源性為98.37%，鑒定結果如表2所示。

2.4 產香酵母發酵液揮發性風味成分分析

H9和J11兩株產香酵母發酵液的揮發性成分氣相色譜圖如圖2、圖3所示，各組分質譜經計算機NIST05.LIB譜庫檢索及相關資料分析，用峰面積歸一化法，計算各組分相對百分含量，并分析各組分的氣味，將揮發性成分按照保留時間先后順序統計，見表3。

圖2 酵母H9麥芽汁發酵液揮發性成分總離子流色譜圖

圖3 酵母J11麥芽汁發酵液揮發性成分總離子流色譜圖

從表3可以看出，酵母J11比酵母H9出峰率高，產生的揮發性成分較多，酵母H9麥芽汁發酵液共分離出11種揮發性風味成分，酵母J11麥芽汁發酵液共分離出17種揮發性成分，兩株產香酵母的麥芽汁發酵液揮發性成分主要是醇類和酯類，但醇和酯的含量以及組成各異。酵母H9麥芽汁發酵液的主體風味物質是醇類，異戊醇和苯乙醇的相對百分含量分別達到57.39%和23.20%，和酵母J11發酵液相比酯類的種類相對較少，這與感官評定其發酵液的主體香味為醇香一致，同時酵母H9發酵液中產生一種特有的具有香辛料、丁香和發酵似香氣和炒花生氣息的酚類揮發性成分4-乙烯基-2-甲氧基苯酚。酵母J11的揮發性成分中含有大量不同的酯類，且大多數具有令人愉悅的香氣，因而賦予該菌株發酵液濃郁的酯香。有研究表明，酵母是具有很大產油潛力的微生物［13］，高媛［14］等也篩選到高產油的假絲酵母。該研究發現酵母J11發酵液中存在大量的高級脂肪酸酯類，包括飽和脂肪酸酯(十二酸乙酯、十四酸乙酯和十六酸乙酯等)和不飽和脂肪酸酯(3，6-十二碳二烯酸甲酯、反式-4-癸烯酸乙酯和9-十六碳烯酸乙酯等)，由此可以推測，酵母J11可能是一株產油脂的酵母菌，其細胞裂解后將代謝產生的脂肪酸釋放到發酵液中，并與發酵液中的低級醇形成脂肪酸酯。

2.5 兩株產香酵母的發酵特性實驗

2.5.1 耐鹽性 食鹽是肉制品加工中必不可少的添加調味料，添加量一般在2%～6%左右，適宜于發酵肉制品的菌株必須有良好的食鹽耐受性，一般要求能夠在至少6%食鹽濃度下能夠正常生長［15］。由圖4可以看出，當食鹽添加量小于4%時，酵母H9和J11的生長狀況良好，但當食鹽的添加量超過4%時，隨著食鹽添加量的增加，兩株酵母的生長開始受到不同程度的抑制，其中食鹽對酵母H9的抑制作用非常明顯。當食鹽添加量達到8%～10%時，酵母H9生長幾乎停滯，而酵母J11的生長略有下降。酵母J11的耐鹽性要明顯好于酵母H9。

表3 菌株H9、J11麥芽汁發酵液揮發性成分相對峰面積及氣味

圖4 不同食鹽含量對酵母H9和J11生長的影響

2.5.2 亞硝酸鹽耐受性 在肉制品的加工中通常通過添加NaNO2對肉制品進行發色，并且NaNO2還有抑制腐敗菌的作用。國家標準規定腌臘肉制品中的亞硝酸鹽的最大使用量為150mg/kg［16］，因此要求用于肉制品發酵的菌種應具有較好的亞硝酸鹽耐受性，一般要求菌種至少能耐受100mg/kg的亞硝酸鹽。由圖5可知，NaNO2添加量在0～150mg/kg范圍內，酵母H9和J11的生長均幾乎不受亞硝酸鹽添加量的影響，具有很好的亞硝酸鹽耐受性。

圖5 不同亞硝酸鹽含量對酵母H9和J11生長的影響

2.5.3 耐酸性 酵母菌通常與乳酸菌復配應用于肉制品發酵，很少單獨使用，因此，酵母菌必須能夠適應乳酸菌所造成的酸性環境［17］。從圖6可以看出，酵母菌H9和J11在pH4.0～7.0范圍內均生長良好，但pH為4.0時，酵母H9的生長受到了些許抑制，但仍能正常生長。

3 結論

從湖北臘魚中分離篩選得到H9和J11兩株產香酵母，分別初步鑒定為季也蒙畢赤酵母(Pichia guilliermondii)和 近 平 滑 假 絲 酵 母 (Candida parapsilosis)。其中，酵母H9(Pichia guilliermondii)麥芽汁液體培養基的主體揮發性風味物質為醇類，還產生一種特有的呈香辛料、丁香和發酵似香氣和炒花生氣息的4-乙烯基-2-甲氧基苯酚;酵母 J11 (Candida parapsilosis)的麥芽汁液體培養基發酵液酯香濃郁，產酯更為豐富，能產生多種高級脂肪酸酯，這可能與其脂肪酸代謝有關。另外，酵母J11與酵母H9相比具有更優良的耐鹽性、亞硝酸鹽耐受性、耐酸性等發酵特性。因此，酵母J11有望開發為新型的肉品發酵劑，酵母H9的耐鹽性較差，有待進一步的馴化和研究。

圖6 不同pH對酵母H9和J11生長的影響

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Screening of aroma-producing yeast strains from dry-cured fish and initial study on their aroma-production and fermentation characteristics

LIANG Hui1，2，MA Hai-xia1，LI Lai-hao1，*
(1.South China Sea Fisheries Research Institute，Chinese Academy of Fishery Sciences，National Research and Development Center for Aquatic Product Processing，South China Research Center for Aquatic Product Processing and Quality Safety，Ministry of Agriculture，Guangzhou 510300，China; 2.College of Food Science，Shanghai Ocean University，Shanghai 201306，China)

Two yeast strains were isolated from dry-cured fish，and initially identified as Pichia guilliermondii(H9) and Candida parapsilosis(J11)by morphological characteristics and 26S rDNAD1/D2 domain sequence analysis. Volatile compounds from malt wort fermentation broth of yeast H9 and J11 were analyzed by headspace solidphase micro extraction(SPME)coupled to gas chromatography-mass spectrometry(GC-MS).Results showed that volatile compounds from malt wort fermentation broth of two species yeast strains were mainly alcohols and esters，but of great difference in kind and composition.Finally，Candida parapsilosis was considered to have the potential to be developed as a new starter culture for meat because of its better fermentation adaptability such as salt tolerance，nitrite tolerance and acid resistance.

dry-cured fish;aroma production;yeast;26S rDNA;fermentation characteristics

TS254.1

A

1002-0306(2011)12-0213-05

產香酵母，是一類能產生香味物質的酵母菌，目前主要分離篩選產香酵母并將其應用于白酒、葡萄酒、果汁、醬油、香精香料中［1］。產香酵母在代謝過程中主要產生醇類和酯類等香味物質，從而賦予食品特有的香氣［2］。微生物作用下醇類和酸類的酯化反應產生具有各種芳香氣味的酯類，對提高產品的風味品質有重要作用。目前，酵母菌對發酵肉制品風味的形成特點尚未有定論［3］。Olesen等［4］發現產朊假絲酵母(Candida utilis)能產生多種揮發性成分，特別是酯類和醇類，而漢遜氏德巴利酵母對揮發性成分的形成幾乎沒有作用;而另一些研究則表明德巴利酵母影響蛋白質水解和揮發性成分產生，適量的德巴利酵母可以通過抑制脂肪氧化和促進乙酯類的形成來影響揮發性產物，但德巴利酵母過量將會產生大量的酸對風味產生負面影響［5-6］。目前，已有很多關于肉制品中優勢細菌(乳酸菌、葡萄球菌和微球菌等)篩選及應用的研究，國外也早已將酵母菌應用于發酵肉制品的生產中，常選用的是漢遜氏德巴利酵母(Dabaryomyces hansenii)和法瑪塔假絲酵母(Candida famata)，但直接從傳統肉制品中篩選優勢自然酵母菌株的研究甚少。國內傳統肉制品(如火腿、香腸、臘魚、臘肉等)中廣泛存在著優良的自然菌株，是分離篩選優良野生菌株的重要來源。該研究從傳統臘魚中篩選產香酵母菌，結合酵母菌的培養形態及26S rDNAD1/D2區序列分析進行快速分類鑒定［7］，并研究其產香特性及其耐鹽性、亞硝酸鹽耐受性和耐酸性等相關發酵特性，旨在分離得到能夠應用于肉制品加工的產香酵母，為開發新的肉制品發酵劑提供一定的理論基礎。

2011-08-26 *通訊聯系人

梁慧(1986-)，女，碩士研究生，從事水產品加工與質量安全研究。

國家現代農業產業技術體系(CARS-49);國家農業科技成果轉化資金項目(2010GB23260577，2009GB2E200303，2010GB2E000335); 廣 東 省 科 技 計 劃 項 目(2009A020700004，2008A020100006;2009B020201003);廣東省海洋漁業科技推廣項目(A200899B02，A200901C01);農業部中央級公益性科研院所基本科研項目(2010YD07)。