苔干多酚氧化酶的酶學特性研究

張 莉，陳乃富

(皖西學院生物與制藥工程學院，安徽六安237012)

苔干多酚氧化酶的酶學特性研究

張 莉，陳乃富

(皖西學院生物與制藥工程學院，安徽六安237012)

研究了苔干(Lactuca sativa var.angustata)多酚氧化酶的酶學性質。結果表明:以鄰苯二酚為底物，該酶的最適pH為7.4，最適溫度30℃，70℃以上溫度使酶迅速失活，動力學方程v=518.96［S］/(0.0166+［S］)，VC、異VC鈉、NaHSO3、L－Cys可完全抑制酶活性，飽和NaCl、10%蔗糖、SDS、EDTA－Na2均可顯著抑制酶活性。該酶能催化鄰苯二酚、焦性沒食子酸氧化，但對鄰苯二酚的親和力更強。

苔干，多酚氧化酶，提取，純化，酶學特性

苔干，又名貢菜、響菜、山蜇菜，是安徽渦陽、江蘇邳州等地的傳統名優特產蔬菜，在分類上屬菊科萵苣屬莖用萵苣(Lactuca sativa var.angustata)［1－2］。苔干的種植加工有悠久的歷史，因其特有的食用價值，早已馳名中外。苔干經刨皮、劃菜成條、晾曬或烘干脫水而制成綠色或淡綠色的干制品。但是苔干無論是在加工過程中，還是在貯藏、銷售等環節均存在褐變問題，影響到產品質量及商品價值。尤其是在加工過程中如因陰天無法晾曬或烘干方法不當，均可因褐變尤其是酶促褐變，引起嚴重的產品質量問題。酶促褐變主要是由多酶氧化酶(Polyphenol oxidase，簡稱 PPO，EC 1.10.3.1)催化引起的［3－4］。本文對苔干多酶氧化酶的酶學特性進行了研究，為科學控制苔干加工、貯藏、銷售過程中的酶促褐變提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

新鮮苔干 采購于安徽渦陽義門鎮，為秋季苔干，新鮮苔干購回時帶葉整株放入－18℃冰箱中冷凍保存。

1.2 實驗方法

1.2.1 PPO粗酶液提取 取100g去掉葉片的苔干，加入300mL預冷的0.2mol/LpH6.8檸檬酸－磷酸緩沖液，按文獻［5］方法制備PPO粗酶液。

1.2.2 PPO的Sephadex G－75柱層析純化 將PPO粗酶液用甘油濃縮至約為原體積的1/6，取此濃縮粗酶液2mL上Sephadex G－75凝膠柱(內徑1.5cm，柱高50cm)以0.2mol/L pH6.8檸檬酸－磷酸緩沖液進行洗脫，洗脫速度為0.5mL/min，自動部分收集器每5min收集一管。將記錄儀記錄的蛋白質峰值附近的5支試管中的洗脫液合并，即為純化的PPO酶液，以此酶液進行酶學特性研究。

1.2.3 PPO的酶學性質 PPO的酶活性的定義與測定、酶促反應的吸收光譜特征、酶促反應速度曲線、pH等對PPO活性影響的測定均參照文獻［5］進行。但是所用測定酶活性的最大波長為410nm。

2 結果與分析

2.1 酶促反應的吸收光譜

圖1所示的是酶促反應開始后連續6次可見光范圍內的掃描的吸收光譜，6次掃描的總時間為14min，每次掃描時間約為2'20″，實驗結果見表1。

圖1 酶促反應產物的吸收光譜

表1 連續掃描的λmax值及OD值變化

結合圖1及表1可知，PPO催化鄰苯二酚反應的產物在不同時間掃描得到的可見光吸收光譜特征相似，均有一個最大的吸收峰，但每次掃描得到的最大吸收波長均不相同，而是隨著酶促反應時間的延長(隨掃描次數的增加)，最大吸收波長λmax在逐漸增大，從第一次掃描的410nm，增加到第六次掃描的444nm。

表1中的OD值1，是用吸收光譜中最大吸收波長λmax在表中所示的掃描次數中得到吸光度值;OD值2是固定用410nm波長在表中所示的掃描次數中得到的吸光度值;隨反應時間的延長，OD值1、OD值2均呈現出逐漸下降的趨勢。這是由于PPO催化鄰苯二酚轉變成醌，醌進一步聚合，最后生成結構更為復雜的黑色素。醌的進一步聚合無需酶的催化能自動進行。所以隨酶促反應時間的延長，OD值會因產物的轉化出現減少趨勢。也正是因為醌的進一步聚合向黑色素方向轉化而使得產物的吸收峰值波長不斷增大，向長波方向偏移。

上述酶促反應的變化趨勢與蕨菜PPO催化鄰苯二酚反應的變化趨勢有相似之處［5］。這也說明在測定PPO活性時，要確定適宜的酶促反應時間，并準確把握這一反應時間來測定OD值是十分重要的。

2.2 PPO的酶促反應速度曲線

圖2所示為苔干PPO催化鄰苯二酚反應速度曲線。可以清楚地看出，隨反應時間的延長，單位時間內的產物生成量一直在減少，即酶促反應的速度在逐漸減小。反應至140s時，產物生成量不再增加，反應至200s后，產物生成量反而呈略下降趨勢，這與2.1項所述吸收光譜及吸光度變化的原因相同，也是因為PPO催化鄰苯二酚轉變為產物醌后，醌可以進一步自動聚合向黑色素方向轉化，使得吸光度減小。但是60s以內的產物生成量與反應時間近似呈線性關系，基本能反映酶促反應的初速度且60s也能滿足實驗操作的需要，所以選用測定酶促反應1min時的OD值來表示酶活性的高低。

2.3 pH對PPO活性的影響

從圖3分析，苔干PPO的最適pH為7.4，這與蕨菜PPO的最適pH相同，與牛蒡PPO的最適pH7.2相近［6］，比蘋果梨PPO最適pH4.6高出近3個pH單位［7］。pH在4～7范圍內，苔干PPO活性變化幅度較小，而在pH7～8范圍內的活性變化幅度非常大，說明苔干PPO在pH為7～8范圍時，對pH的變化非常敏感，很小的pH變動，會引起酶活性發生很大變化。當pH降至7以下時，PPO活性也減小到最適pH時活性的25%以下，當pH降至4時，酶活性只相當于pH7.4時活性的11.3%。說明對于苔PPO而言，pH在7以下就可有效抑制其活性，從而減少褐變的發生。

圖2 PPO 反應速度曲線

圖3 PPO活性與pH的關系

2.4 溫度對PPO活性的影響

圖4說明，苔干PPO的最適溫度為30℃，在15～45℃范圍內均表現較高的活性，15～30℃時隨溫度的升高PPO活性逐漸增大，30℃以上時的酶活性表現下降趨勢。圖5所示的為PPO酶液在60、70、80、90、100℃水浴中保溫一定時間后測定的活性與室溫放置酶液測定活性的比值(%)。從圖5可以看出，70℃以上溫度有利于鈍化酶的活性;80℃水浴溫度處理60s，PPO活性只有未處理活性的23.5%;90℃處理60s、100℃處理30s，PPO活性均降至20%以下; 90℃以上溫度處理120s后，PPO活性基本消失。說明采用短時高溫的熱處理方法是一種有效的鈍化苔干PPO活性的方法。

圖4 PPO活性與溫度的關系

2.5 底物濃度對PPO活性的影響

圖5 PPO的熱穩定性

相關系數r=0.9940，如圖6所示。從圖6中可以得出，Vmax=518.96u，Km=1.66×10－2mol/L。苔干PPO以鄰苯二酚為底物的動力學方程為

圖6 底物濃度對反應速度的Lineweaver－Burk圖

2.6 抑制劑對PPO活性的影響

如表2所示抑制劑的抑制效果，其中PPO相對活性是指各種含抑制劑的酶活性與不含抑制劑的酶活性的比值(%)。由表2分析:VC、異VC鈉、NaHSO3、L－Cys在0.1%～1%濃度范圍對PPO皆表現出強烈的抑制作用，而且隨濃度增大抑制效果增強，直至完全抑制。其中VC、異VC鈉一方面能抑制PPO酶本身的催化作用，同時又能還原PPO形成的產物醌為酚，并且還消耗反應體系中的氧。NaHSO3與L－Cys能與醌類形成無色聚合物又能還原醌，因此，它們都表現出強烈的抑制作用。飽和NaCl也能較強地抑制酶活性。10%蔗糖和一定濃度的SDS也表現較強的抑制作用，這與它們對蕨菜PPO的影響不同，二者對蕨菜PPO有一定激活作用［5］。不同濃度的EDTA－Na2表現出不同的抑制效果，濃度越高抑制作用越強。EDTA－Na2對PPO活性的影響可能是與酶分子中Cu2+結合而抑制酶的活性［5，7－8］。苯甲酸鈉隨濃度的增大，也略表現一定的抑制作用，但抑制效果沒有其它的抑制顯著。綜上分析認為，選擇適當的抑制劑來抑制PPO活性是控制酶促褐變的一條有效途徑。

2.7 PPO催化不同底物反應的結果分析

表3所示苔干PPO催化鄰苯二酚(0.04mol/L)、焦性沒食子酸(鄰苯三酚，0.04mol/L)、愈創木酚(0.04mol/L)、L－酪氨酸(飽和濃度)四種底物反應的產物吸光度，由于焦性沒食子酸在堿性條件下可以發生自氧化，故這里酶促反應選用的是pH6.8而不是pH7.4的檸檬酸－磷酸緩沖液。

表2 抑制劑對PPO活性的影響

表3 PPO催化不同底物的酶活性

以鄰苯二酚為底物的酶活性為100，另外三種底物的酶活性分別與以鄰苯二酚為底物的酶活性相比，得相對活性(%)，見表3。從表3看出，PPO催化不同底物的活性差異較大，愈創木酚、L－酪氨酸不是其適宜底物，而鄰苯二酚、焦性沒食子酸則是其適宜底物，但對鄰苯二酚的親和力更強。這與有關文獻［5，8－9］報道相一致。

3 結論

3.1 苔干多酚氧化酶催化鄰苯二酚生成的產物在410nm處有最大吸收峰，但隨反應時間的延長，最大吸收峰有向長波偏移的趨勢。測定酶促反應1min時的速度能基本反映酶促反應的初速度。

3.2 pH對酶活性影響顯著，酶的最適pH為7.4，調pH至偏酸環境可有效地抑制PPO活性。

3.3 反應體系溫度在15～45℃范圍內酶活性較高，最適溫度為30℃。酶的熱穩定性差，70℃以上短時高溫可有效鈍化酶活性。

3.4 以鄰苯二酚為底物的PPO動力學方程為:v= 518.96［S］/(0.0166+［S］)。

3.5 酶的適宜底物為鄰苯二酚(二元酚)及焦性沒食子酸(三元酚)。VC、異VC鈉、NaHSO3、L－Cys對酶都有極強的抑制作用;飽和NaCl、10%蔗糖、SDS、EDTA－Na2也有顯著抑制效果;苯甲酸鈉抑制效果較差。

［1］安徽省科學技術廳.安徽植物志［M］.第四卷.合肥:安徽科技出版社，1991:635－636.

［2］郭文場，楊松濤，呂忠寧.古來“貢菜”話苔干［J］.植物雜志，2001(1):27－28.

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Enzymologic properties of polyphenol oxidase of Lactuca sativa var.angustata

ZHANG Li，CHEN Nai－fu
(Department of Biological and Pharmaceutical，West Anhui University，Liu’an 237012，China)

The kinetic property of polyphenol oxidase(PPO)in Lactuca sativa var.angustata was analyzed.The result showed that，by using the catechol as the substrate，the most suitable pH and temperature for this enzyme was at 7.4 and 30℃，respectively，and it would be rapid inactivated if the temperature went above 70℃.The kinetic equation was v=518.96［S］/(0.0166+［S］)，and VC，sodium D－isoascorbate，NaHSO3，L－Cys could completely inhibit PPO activity.Saturated NaCl，sugar(10%)，SDS and EDTA－Na2could remarkably inhibite PPO activity.This enzyme could catalyze the oxidization of catechol and pyrogallic acid，and had higher affinity to catechol.

Lactuca sativa var.angustata;polyphenol oxidase(PPO);extraction;purifying;kinetic property

TS255.1

A

1002－0306(2011)12－0200－04

2011－08－31

張莉(1973－)，女，碩士，副教授，研究方向:天然產物開發利用。