琯溪蜜柚皮乙醇提取物的抑菌及防腐效果

鄭藝梅，許開城，陳蕓蕓

(1.漳州師范學院生物科學與技術系，福建漳州363000; 2.漳臺休閑食品技術創新中心，福建漳州363000)

琯溪蜜柚皮乙醇提取物的抑菌及防腐效果

鄭藝梅1，2，許開城1，陳蕓蕓1，2

(1.漳州師范學院生物科學與技術系，福建漳州363000; 2.漳臺休閑食品技術創新中心，福建漳州363000)

以乙醇作提取劑，制備琯溪蜜柚皮提取物，探討其對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、啤酒酵母和黑曲霉的抑菌效果。濾紙片擴散法測定蜜柚皮醇提物的抑菌活性，固體稀釋法測定蜜柚皮醇提物的最小抑菌濃度，研究了溫度、pH對蜜柚皮醇提物抑菌效果的影響，并進行了果蔬的防腐保鮮初步實驗。結果表明，蜜柚皮醇提物對金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、啤酒酵母具有較強的抑菌效果，其最低抑菌濃度分別為6.25%、12.5%和12.5%;對大腸桿菌和黑曲霉沒有明顯的抑菌效果。蜜柚皮醇提物的抑菌效果受溫度影響較小，受pH影響較大，酸性環境下抑制作用較強。蜜柚皮醇提物具有良好抑菌和防腐保鮮效果，可作為天然食品防腐劑進行開發和利用。

蜜柚皮，乙醇提取物，抑菌效果，防腐效果

食品的腐敗變質主要由微生物引起，傳統的化學防腐通常會掩蓋或破壞食品的營養和自然風味等，而且還涉及到安全性問題。研發天然食品防腐劑已成為食品科學領域研究的熱點。琯溪蜜柚是分布于福建省漳州市平和縣的特有柚子品種，種植面積達4萬hm2，年產量達60萬t，約占全國柚類總產量的25%［1］。在鮮食或加工中，占果實總量約45%的蜜柚皮作為廢棄物丟棄，造成了環境污染和資源的浪費。研究表明，柚皮含有多種生理活性成分［2］，其提取物的抑菌［3－5］和抗氧化［6－8］作用因柚子品種、提取劑等不同而有差異;柚皮提取物用于果蔬防腐保鮮很少［9］，而琯溪蜜柚皮乙醇提取物的抑菌效果及其影響因素、對果蔬的防腐效果方面未見報道。本實驗研究琯溪蜜柚皮乙醇提取物對常見細菌、霉菌和酵母菌的抑制效果及其影響因素，并進行果蔬的防腐保鮮初步實驗，探討其實際防腐效果，以期為天然食品防腐劑的開發提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮琯溪蜜柚 采自平和縣，蜜柚洗凈擦干，取外皮烘干、粉碎后備用;供試菌種 細菌－金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、大腸桿菌(Escherichia coli)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis);霉菌－黑曲霉(Aspergillus niger);酵母菌－啤酒酵母(Saccharomyes cerevisiae)，以上菌種均由本系微生物實驗室提供;無水乙醇、氫氧化鈉、氯化鈉、蔗糖、鹽酸等 分析純試劑;胰化蛋白胨，瓊脂粉，酵母浸膏，102型新華濾紙。

RE52－99旋轉蒸發器 上海亞榮生化儀器廠; TGL－20M臺式高速速凍離心機 湖南賽特湘儀離心機儀器有限公司;PYX－250G－B光照培養箱 廣東韶關科力實驗儀器有限公司;GZX－9140ME數顯鼓風干燥箱 上海博訊實業有限公司醫療設備廠; HH－2數顯恒溫水浴鍋 江蘇省金壇市江南儀器廠;潔凈工作臺 蘇州安泰空氣技術有限公司;LDZX－50KB立式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫療器械廠; HK－02A手提式粉碎機 廣州市旭朗機械設備有限公司。

1.2 蜜柚皮醇提物的制備

取300g粉碎后的蜜柚皮置于燒杯中，按料液比1∶10加入70%的乙醇溶液，置于電爐上，80℃下提取3次，每次30min，合并濾液，8000r/min離心10min，取上清液，再在旋轉蒸發器濃縮，得到1∶1的濃縮液備用。1∶1濃縮液定義為1mL提取液中含有1g蜜柚皮粉原料。

1.3 培養基的制備［10］

1.3.1 LB培養基 取胰化蛋白胨10.0g、酵母浸膏5.0g、氯化鈉10.0g、瓊脂粉20g、水1000mL，加熱溶化，調pH 7.4～7.6，高壓濕熱滅菌(121℃，20min)，備用。

1.3.2 豆芽培養基 取豆芽100g和水1000mL放入燒杯煮沸30min，紗布過濾，去離子水補足原量，再加入蔗糖50g和瓊脂粉20g，加熱溶化，pH為自然狀態，分裝，高壓濕熱滅菌(121℃，20min)，備用。

1.4 供試菌液制備［11］

1.4.1 細菌菌懸液和酵母菌菌懸液的制備 細菌用LB培養基，酵母菌用豆芽培養基。將供試菌種分別接種到裝有對應培養基的試管內進行擴大培養。細菌在37℃培養24h，酵母菌在28℃培養24h。取活化好的菌種斜面，用無菌水配制成(1～10)× 106CFU/mL的菌懸液，備用。

1.4.2 霉菌孢子懸液的制備 將供試菌種分別斜面接種到豆芽培養基中，在28℃培養72h，取活化好的菌種斜面，用無菌水配制成(1～10)×106CFU/mL的霉菌孢子菌懸液，備用。

1.5 抑菌實驗

1.5.1 濾紙片法測定抑菌活性［12］將吸水性強的濾紙用打孔器打成直徑6mm的圓形小紙片，分裝于潔凈干燥的培養皿中，干熱滅菌(160℃，2h)后，備用。用無菌鑷子將濾紙片放入無菌水和70%的乙醇提取物(1∶1濃縮液)中作空白對照實驗，均浸泡30min，取出后瀝去多余的試液晾干。取制備好的菌懸液0.5mL，滴入已經倒有相應固體培養基的平皿表面，用涂布器使其均勻分布在培養基的表面。用無菌鑷子夾取浸有上述2種液體的濾紙片，放入含菌平皿中，每皿無菌水的放1片、醇提物的放3片。然后將各平皿放入每種菌適宜的溫度培養箱內培養(細菌37℃，培養24h;酵母菌、霉菌28℃，培養48h)。每種菌種做2皿重復實驗，取抑菌圈直徑平均值。

1.5.2 最低抑菌濃度的測定［13］醇提物進行二倍稀釋。將醇提物溶液換成 50、25、12.5、6.25、3.125、1.563、0.782mg/mL，在各平皿倒入10～15mL醇提物進行二倍稀釋已溶化的固體培養基，混勻、冷卻、凝固后，每皿加入0.5mL菌懸液，涂勻，在相應的溫度下培養一定時間(同上)，觀察每皿生長情況。每個濃度做2個重復實驗。

1.5.3 耐熱性的測定 取蜜柚皮醇提物，用4支小試管每支分裝3mL，用無菌鑷子將濾紙放進各試管中，1支于常溫下放置，另外3支分別置60、80、100℃下處理30min，取出按1.5.1量取抑菌圈直徑，以常溫處理的作空白對照。

1.5.4 抑菌 pH范圍的測定［14］用 NaOH溶液和HCl溶液調節蜜柚皮醇提物的pH分別為4、4.68、5、6、7、8、9，按1.5.1量取抑菌圈直徑，以未處理的蜜柚皮醇提物作空白對照。

2 結果與分析

2.1 蜜柚皮醇提物抑菌效果

蜜柚皮提取物抑菌效果如表1所示。

表1 蜜柚皮醇提物抑菌效果

濾紙片法測定結果(表1)顯示，蜜柚皮醇提物對金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌和啤酒酵母有較強的抑菌作用，對大腸桿菌和黑曲霉未顯示抑制作用。對供試菌的抑制作用相對強弱次序為:金黃色葡萄球菌＞啤酒酵母＞枯草芽孢桿菌。

李春美等［5］實驗發現，葡萄柚柚皮60%的乙醇提取物對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、黑曲霉具有較強的抑制作用。蔣玲艷等［4］研究表明，沙田柚柚皮95%的乙醇提取物對枯草芽孢桿菌具有較強的抑制作用，對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌及酵母菌的抑制相對較弱，對黑曲霉沒有明顯的抑菌效果。戴玉錦等［7］用70%乙醇及無水乙醇制備的高黃酮含量蜜柚皮提取物，對大腸桿菌抑制作用明顯，而對黑曲霉抑制作用不明顯。

本實驗與以上研究結果相比較，柚皮醇提物對相同微生物的抑菌作用相似或不同，分析其原因可能是柚子品種不同、提取劑乙醇濃度不同等影響的。

表5 蜜柚皮醇提取物的防腐效果

基于表1顯示的抑菌效果，以金黃色葡萄球菌、啤酒酵母、枯草芽孢桿菌三種菌為供試菌，確定蜜柚皮醇提取物的最小抑菌濃度，進而研究溫度、pH對蜜柚皮醇提物抑菌作用效果的影響。

2.2 蜜柚皮醇提物最低抑菌濃度

蜜柚皮醇提物最低抑菌濃度見表2。

表2 蜜柚皮醇提物最低抑菌濃度

從表2可以看出，隨著醇提物濃度的增大，抑菌能力也逐漸增強;蜜柚皮醇提物對枯草芽孢桿菌和啤酒酵母的最低抑菌濃度最小都是12.5%，對金黃色葡萄球菌的最低抑菌濃度最小為6.25%。李春美等［5］研究結果表明葡萄柚皮對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的最低抑菌濃度最小均為2.5%，實驗結果不同的原因同2.1的分析。

2.3 溫度對蜜柚皮醇提物抑菌效果的影響

醇提物分別在60、80、100℃和常溫下處理30min后，測得其抑菌圈直徑如表3所示。

表3 溫度對蜜柚皮醇提物抑菌效果的影響(mm)

由表3可以看出，對同一種微生物，不同溫度處理后醇提物的抑菌圈直徑大小相近，表明蜜柚皮醇提取物的抑菌作用受溫度影響不大。這與文獻［4］和［5］的報道不一致，這可能與處理的方法、柚皮中抑菌成分及其耐熱性不同有關。

2.4 pH對蜜柚皮醇提物抑菌作用的影響

pH對蜜柚皮醇提物抑菌作用的影響見表4。

表4 pH對蜜柚皮醇提物抑菌效果的影響(mm)

從表4可知，蜜柚皮醇提物對金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、酵母菌的抑菌作用隨pH的升高而減弱。蜜柚皮醇提取物本身呈酸性，其溶液自然pH為4.68，酸性pH下抑菌效果較好，在中性環境下，醇提物對金黃色葡萄球菌和啤酒酵母仍有抑菌作用，抑菌次序是金黃色葡萄球菌＞啤酒酵母，但對枯草芽孢桿菌沒有抑菌效果，堿性環境下均無抑菌效果。說明蜜柚皮醇提物在偏酸pH下抑菌效果更強。這與文獻［5］的結果一致。

2.5 防腐保鮮效果

選取新鮮的蘑菇、葡萄和圣女果，洗凈、瀝干后放入醇提物(1∶1)中浸泡30min，取出晾干，分裝于經過滅菌的培養皿中，置于30℃培養8d。肉眼觀察以上果蔬感官變化，用無菌水作空白對照實驗，結果見表5。

從表5可以看出，經過醇提物處理的果蔬在貯藏期間，其感官性狀明顯優于未經處理的。實驗第4d時未處理的葡萄已經有失水現象，而經過醇提物處理的葡萄還保持一定的硬度。第8d時未處理的葡萄出現軟腐，顏色變為黑紫色，而經過醇提物處理的葡萄僅變軟，顏色為深紫紅。未處理的圣女果第4d表皮出現微皺縮，而經過醇提物處理的保持一定的硬度，第8d時圣女果已經變軟，汁液有滲出，而經過醇提物處理的只稍萎，但硬度依然保持。蘑菇在貯藏過程中外觀形態變化很大。觀察實驗第4d時，未處理的蘑菇已經汁液滲出，嚴重發霉、發臭，而經過醇提物處理的蘑菇汁液有點滲出，菇面比較亮，說明蜜柚皮醇提物具有良好的防腐效果。

3 結論

蜜柚皮醇提取物對金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、啤酒酵母有較強的抑菌效果，對大腸桿菌和黑曲霉沒有抑菌效果。對金黃色葡萄球菌的最低抑菌濃度為6.25%，對枯草芽孢桿菌和酵母菌的最低抑菌濃度均為12.5%。蜜柚皮醇提物的抑菌作用受溫度影響不大，但受pH的影響較大，酸性環境下抑制作用較強。蜜柚皮醇提取物具有良好抑菌和防腐保鮮效果，可作為天然食品防腐劑進行開發和利用。

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Study on antimicrobial and preservation effect of the ethanol extract from honey pomelo peel

ZHENG Yi－mei1，2，XU Kai－cheng1，CHEN Yun－yun1，2
(1.Department of Biological Science and Technology，Zhangzhou Normal University，Zhangzhou 363000，China; 2.Technological Innovation Center of Zhangzhou and Taiwan Leisure Foods，Zhangzhou 363000，China)

The ethanol extract was prepared from honey pomelo peel，and its antimicrobial effect on Escherichia coli，Staphylococcus aureus，Bacillus subtilis，Saccharomyces cerevisiae and Aspergillus niger were studied.The filter paper diffusion method and solid dilution method were used to determine the antimicrobial activity and the minimal inhibitory concentration(MIC)，respectively.The influence of the temperature and pH on the antimicrobial effect was studied also.Meanwhile，the preliminary preservation test of fruit and vegetable was conducted.The results showed that ethanol extract of pomelo peel had a strong antimicrobial activity to Staphylococcus aureus，Bacillus subtilis，Saccharomyces cerevisiae and the minimum inhibitory concentration was as follow:6.25%，12.5%，12.5%，respectively，but no significant effect to the Escherichia coli and Aspergillus niger.The antimicrobial effect was little affected by temperature，while influenced largely by pH and strong effect in acid condition.The ethanol extract from honey pomelo peel had better antimicrobial and preservation effect，and could be developed as a natural food preservative agent.

honey pomelo peel;ethanol extract;antimicrobial effect;preservation effect

TS201.2

A

1002－0306(2011)12－0165－04

2011－09－01

鄭藝梅(1966－)，女，博士，教授，研究方向:農產品貯藏與加工、食品營養與安全等。

漳州師范學院引進人才啟動基金(L20919);福建省教學質量與教學改革工程項目(閩教高［2011］69號);漳州師范學院2010年大學生創新性實驗計劃項目(201008)。