生物催化合成1,3-丙二醇工藝的研究

冷桂華，王瑞君，孫萬里

(宜春學院化學與生物工程學院，江西省天然藥物活性成分研究重點實驗室，江西宜春336000)

生物催化合成1,3-丙二醇工藝的研究

冷桂華，王瑞君，孫萬里

(宜春學院化學與生物工程學院，江西省天然藥物活性成分研究重點實驗室，江西宜春336000)

以甘油為底物，利用克雷伯氏菌發酵生產1，3－丙二醇的實驗中，考察了初始甘油濃度、溫度、pH、通氣策略等發酵條件對1，3－PDO產量的影響。實驗結果表明:積累1，3－PDO的適合條件為:甘油的初始濃度為40g/L、發酵溫度37℃、pH7.0、0.5V/V·min的通氣量，發酵30h，反應液中PDO的產量可達57.63g/L。

生物合成，1，3－丙二醇，發酵，工藝

克雷伯氏肺炎桿菌(Klebsiella pneumoniae) 由華東理工大學國家化生中心提供;粗甘油 工業級，上海化學試劑采購供應站中心化工廠;酵母浸膏生化級，北京奧博星生物技術有限責任公司;甘油分析純，天津市福晨化學試劑廠;維生素B12、甘氨酸生化級，上海國藥集團化學試劑有限公司;1，3－丙二醇、高碘酸納 分析純，上海國藥集團化學試劑有限公司;K2HPO4、KH2PO4分析純，成都科龍化工試劑廠;(NH4)2SO4、MgSO4·7H2O、FeSO4·7H2O、MnSO4·4H2O 分析純，天津市永大化學試劑開發中心;KOH 化學純，上海光華化學試劑廠;種子培養基(g/L) 甘油10，葡萄糖4，K2HPO4·3H2O 0.8，KH2PO40.5，(NH4)2SO42，MgSO4·7H2O 0.5，酵母浸膏3，微量元素1mL，Fe2+溶液0.5mL;發酵培養基(g/L) 甘油40，葡萄糖2，K2HPO41.2，KH2PO40.4，(NH4)2SO43，MgSO4·7H2O 0.5，酵母粉1.5，微量元素1mL，鐵溶液0.6mL;微量元素成分和鐵溶液的配制 參照文獻［5］。

DSX－280A不銹鋼滅菌器 上海申安醫療器械廠;SPX－250BS－Ⅱ生化培養箱 上海新苗醫療器械制造有限公司;UV－2000紫外分光光度計 尤尼柯儀器有限公司;BIOTECH－7BGZ磁力攪拌發酵罐上海保興生物設備工程公司;SP－3420A氣相色譜儀北京北分瑞利儀器有限公司;BCM－1000A生物潔凈工作臺 蘇州安泰空氣技術有限公司;BS224S電子分析天平 北京賽多利斯儀器有限公司。

1.2 1，3一丙二醇的發酵培養方法

1.2.1 種子培養 250mL三角瓶棉塞加牛皮紙封口，裝液量100mL，接入斜面菌苔1環，在37℃的生化培養箱、轉速為150r/min下培養12h。

1.2.2 發酵培養

1.2.2.1 分批發酵 在5L發酵罐中，裝入發酵培養基4L，接種量為5%(v/v)，攪拌速度200r/min，發酵溫度37℃，通氣量0.5V/V·min，發酵過程中體系pH用5mol/L的NaOH自動調控為7.0。

1.2.2.2 補料分批發酵 在5L發酵罐中，裝入發酵培養基3L，接種量為5%(v/v)，攪拌速度200r/min，發酵溫度37°C，通氣量0.5V/V·min，發酵過程中體系pH用5mol/L的NaOH自動調控為7.0。在初始甘油降到15g/L以下時開始流加底物甘油，保持甘油濃度在15～25g/L范圍內。

1.3 分析方法

1.3.1 生物量測定 采用比濁法，以未接種的發酵培養基為對照，分光光度計于650nm處檢測細胞的濃度，根據干重與OD650對應的標準曲線計算。

1.3.2 目的產物1，3－丙二醇以及副產物乙酸和乙醇含量的測定 氣相色譜法測定，檢測器為FID，色譜柱為毛細管柱，柱溫130℃，汽化室與檢測器的溫度均為240℃，載氣為N2，進樣量0.5μL，采用外標法定量。

1.3.3 甘油、葡萄糖含量測定 分別采用高碘酸氧化法［6］、DNS比色法［7］。

2 結果與分析

2.1 在分批發酵中初始甘油濃度對發酵的影響

利用克雷伯氏菌的PDO發酵中，甘油是發酵底物中的物質基礎，提供碳源和能源，其濃度對產物1，3－丙二醇有較大的影響。分別取20、40、60、80g/L的初始甘油濃度進行分批發酵實驗，實驗結果見圖1、圖2。

圖1 分批發酵過程中不同初始甘油濃度(g/L)下生物量的變化

由圖1可知，甘油初始濃度在20～60g/L范圍內的菌體生長比較好，菌體生長15h左右基本上處于停滯狀態，初始甘油濃度60g/L稍有生長，但增殖較小，發酵30h其菌密度比其它兩種情況稍高些。初始甘油濃度為80g/L時，生長相對緩慢得多，菌體密度也偏小。由圖2可以看出，初始甘油濃度分別為40g/L和60g/L時，二者的PDO生物合成情況有相似之處，前者比后者更早到達最大產量，且濃度稍高些。初始甘油濃度分別為20g/L和80g/L時，二者的PDO生物合成情況也有相似，相比之下，80g/L時的PDO濃度低了很多。結合圖1、圖2，初始甘油濃度20g/L，在發酵初期的菌體生長旺盛，可能由于碳源的缺乏影響了PDO的合成。40～60g/L的初始甘油，細胞生長良好，PDO濃度也高，可能由于底物的抑制作用較小。80g/L的初始甘油濃度過高對發酵有抑制作用［8］，主要是生成高濃度的3－羥基丙醛，在細胞中積累到一定濃度，會毒害細胞，使發酵終止。綜合成本考慮，分批發酵中甘油初始濃度選為40g/L最佳。

圖2 分批發酵過程中不同初始甘油濃度(g/L)下1，3－丙二醇含量的變化

2.2 流加補料發酵中溫度對1，3－丙二醇生成的影響

溫度是影響微生物生長代謝的基本環境因素之一，酶活對溫度的變化很敏感，合適的溫度將有利于酶促反應，有利于產物的形成。克雷伯氏肺炎桿菌屬于腸道細菌，生長溫度應該接近人體溫度，實驗選用34、37、40℃三個溫度情況來考察溫度對PDO轉化的影響，結果如圖3所示，由圖3可以看出，37℃下的1，3－丙二醇的產量最高，達到57g/L左右。在40℃條件下其1，3－丙二醇的產量很低。在34℃下產物的最高濃度達 38g/L左右，所以溫度偏低(34℃)、偏高(40℃)都會影響發酵產物的產生，低溫可能影響1，3－丙二醇形成的酶系活力，高溫可能對于細胞有極大的破壞，因此37℃為1，3－丙二醇生物合成中的較理想溫度。

圖3 流加補料發酵中溫度對1，3－丙二醇生成的影響

2.3 流加補料發酵中pH對1，3－丙二醇生成的影響

微生物的生長和代謝中，環境的pH對細胞的生長與代謝有著重要影響，同樣微生物代謝的活動反過來又會影響環境液的酸堿狀態。克雷伯氏肺炎桿菌屬于腸道細菌，其生長環境在pH6.5～7.5之間，實驗方法采用對比實驗，考察pH為6.5、7.0、7.5和不調pH條件下整個發酵過程中PDO的生成情況。

圖4表明發酵液的pH在6.5～7.5之間，產物的積累可以延續到25～30h，在pH為7的條件下產量可達到57g/L左右，濃度最大，這與有關報道克雷伯氏肺炎桿菌產生1，3－丙二醇的最適酸堿環境pH為7.0左右相適［9］，而不調pH條件下產物的積累只能持續10h，并且產量很低，只有15g/L左右，這與克雷伯氏肺炎桿菌代謝甘油，產生有機酸如乙酸，乳酸等，使pH下降，使菌體的生長代謝也受到抑制有著非常密切的關系。

圖4 流加補料發酵中pH對1，3－丙二醇生成的的影響

2.4 通氣策略對1，3－丙二醇生成的影響

克雷伯氏肺炎桿菌利用甘油作為底物進行分解代謝時，其代謝途徑見文獻［10］，在好氧情況下，代謝主要經3－磷酸甘油代謝;在厭氧情況下，甘油代謝將主要通過二羥丙酮途徑。目前有許多報道關于1，3－丙二醇在有氧參與的情況下發酵的研究，其產量、生產強度等發酵結果要高于厭氧發酵［11］。為此實驗設計了三種通氣策略來優化發酵條件。Ⅰ:整個發酵過程不通空氣;Ⅱ:發酵0～20h通0.5V/V·min空氣，20～40h不通空氣;Ⅲ:全發酵過程通0.5V/V· min空氣。實驗結果如圖5所示。

圖5 流加補料發酵中通氣策略對發酵的影響

由圖5可見，在第Ⅱ和第Ⅲ通氣策略下，其OD650始終大于第Ⅰ情況，而且菌體增殖持續時間更長。三種情況下產物PDO生成量的差別不是很大，Ⅲ在30h積累量最大，接近57g/L，Ⅱ的產量達55.65g/L，不通氣情況下最小。考慮到生產成本與操作的方便性，選用全發酵過程通0.5V/V·min空氣來發酵生產。

3 結論與討論

3.1 發酵液中的初始甘油為40g/L，為克雷伯氏肺炎桿菌利用甘油作為底物進行生長代謝提供碳源和能量，代謝中間產物3－羥基丙醛濃度不高，這種有毒的化合物能及時被轉化，解除3－羥基丙醛的積累，有利于1，3－丙二醇的合成。

3.2 發酵液的溫度維持在37℃下，甘油轉化成1，3－丙二醇過程中的三個關鍵酶－甘油脫氫酶(GDH)、甘油脫水酶(GDHt)和1，3－丙二醇氧化還原酶(PDOR)的酶活力達到較佳狀態，PDO的產率相對較高。

3.3 發酵過程中pH為7.0的條件下，菌體生長良好，PDO生物合成量最高，有幾方面的原因:a.GDHt甘油脫水酶的活性恰好在pH為7.0的時候最高［12］，甘油脫水酶為甘油向PDO轉化途徑的第一個酶，為1，3－丙二醇發酵幾個關鍵酶中的限速酶;b.發酵液中的pH影響著細胞內的氧化還原電位，影響到NADH/NAD的含量，而PDO合成途徑與胞內輔酶的氧化、還原狀態相關，也就間接影響到PDO的合成; c.pH對克雷伯氏菌合成1，3－丙二醇過程中的副產物如丁二酸、乳酸、乙酸、乙醇和2，3－丁二醇等有顯著影響［13］，過多的副產物都會毒害細胞，也抑制產物的形成。

3.4 通氣量在0.5V/V·min的微好氧條件對1，3－丙二醇的發酵最有利。氧氣的存在會對PDO發酵中幾種關鍵酶的活性產生抑制作用［14］，但通入微量的空氣，對發酵反而有明顯的促進作用。原因可能是前期菌體生長時氧的供應對菌體生長有利;微量氧作為氫受體有利于調節氧化途徑和還原途徑之間的NAD+/NADH平衡，消除厭氧途徑積累的大量NADH。

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Study on the biocatalysis synthetic technique of 1，3－propanediol

LENG Gui－hua，WANG Rui－jun，SUN Wan－li
(Chemical and Biological Engineering College，Yichun University，Key Laboratory of Jiangxi Province for Research on Active Ingredients in Natural Medicines，Yichun 336000，China)

The effects of glycerol concentrations，temperature，pH and aeration strategies were investigated on the production of 1，3－propanediol with glycerol as substrate by Klebsiella pneumoniae.The results showed that the most suitable condition of accumulating 1，3－PDO were glycerol concentrations 40g/L，temperatures37℃，pH7.0 and aeration rate 0.5V/V·min，fermentation time 30h，respectively.The PDO concentration in the fermentation broth reached 57.63g/L.

biosynthesis;1，3－propanediol;fermentation;technique

TS201.1

B

1002－0306(2011)12－0136－04

1，3－丙二醇(1，3－propanediol，簡稱1，3－PDO)是一種重要的化工原料，可直接用作防凍劑，是增塑劑、洗滌劑、防腐劑和乳化劑的合成原料［1］，廣泛用于食品、化妝品和制藥等行業［2］。目前1，3－丙二醇最主要的用途是作為合成聚酯、聚氨酯的主要原料，聚對苯二甲酸丙二酯(PTT)是一種新型聚酯材料，具有許多優良特性，主要用于生產纖維和紡織品，是合成纖維新品種開發的熱點［3］，制約PTT發展的關鍵因素在于1，3－丙二醇的成本問題。1，3－丙二醇可通過化學法和生物法生產［4］，化學法生產消耗了不可再生的有限資源，造成環境污染，同時化學法生產原料及設備要求高，生產存在設備投資大、工藝復雜、條件苛刻和環境污染，且原料石油資源日益匱乏等問題;生物法具有原料可再生、操作簡便、反應條件溫和、副產物較少、環境污染小等優點，越來越受到人們的重視，各國都致力于研發生物技術合成1，3－丙二醇。本文以甘油為主要底物、以克雷伯氏肺炎桿菌為菌種，探討發酵生產1，3－丙二醇的條件，以提高1，3－PDO轉化率，降低其成本。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

2011－09－01

冷桂華(1968－)，女，碩士，副教授，研究方向:食品生物技術。

江西教育廳計劃項目資助(GJJ10603)。