抗菌肽BUFORINⅡ衍生物的生物活性研究

郝 剛，樂國偉，施用暉，唐俊妮

(1.西南民族大學生命科學與技術學院，四川成都610041; 2.江南大學食品學院，江蘇無錫214122)

抗菌肽BUFORINⅡ衍生物的生物活性研究

郝 剛1，樂國偉2，施用暉2，唐俊妮1

(1.西南民族大學生命科學與技術學院，四川成都610041; 2.江南大學食品學院，江蘇無錫214122)

研究了抗菌肽BF2－A/B的抗菌活性及其他的生物活性。兩個肽均具有很強的廣譜抗菌活性，BF2－B對細菌的抑菌活性比BF2－A強，它們沒有體外溶血活性。BF2－A幾乎沒有細胞毒性，而BF2－B在100μg/mL時，能抑制大約20%的腫瘤細胞生長。兩個肽均能結合脂多糖，中和內毒素，BF2－B與脂多糖的親和結合力比BF2－A強。BF2－A/B經胃蛋白酶和胰蛋白酶處理后，抗菌活力都略有下降，而經蛋白酶K處理一段時間后，就完全喪失了抗菌活性。

抗菌肽，BuforinⅡ，衍生物，生物活性

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

胃蛋白酶 上海生物工程有限公司;胎牛血清、RPMI1640 華美生物工程有限公司;胰蛋白酶、噻唑藍(MTT)Sigma公司;蛋白酶K Merck產品;顯色基質鱟試劑盒 廈門鱟試劑實驗廠有限公司。

HYG－A型恒溫調速搖床柜 江蘇太倉市實驗設備廠;Multiskan MK3酶聯免疫檢測儀 美國Thermo公司;UV－2102 PCS紫外可見分光光度計優尼科有限公司;CO2培養箱 美國Thermo公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 衍生肽BF2－A/B抗菌活性的測定 按最低抑菌濃度(Minimal inhibitory concentration，MIC)測定法［6］檢測衍生肽BF2－A/B對大腸桿菌、鼠傷寒沙門氏菌、金黃色葡萄球菌等G+、G－菌及白色念珠菌、釀酒酵母等真菌的抗菌活性。

表1 抗菌肽BF2－A/B的最低抑菌濃度MIC(μg/mL)

1.2.2 抗菌肽對細菌的抑菌曲線 將培養至對數生長期的大腸桿菌菌液加入到試管中，再加入抗菌肽溶液，使其終濃度分別為5μg/mL和10μg/mL，對照組加等量無菌水。37℃水浴搖床培養，每隔30min用分光光度計測630nm處的OD值。金黃色葡萄球菌也做同樣處理。

1.2.3 抗菌肽體外溶血實驗 收集新鮮小鼠全血，肝素抗凝，4℃3000r/min離心10min取沉淀，生理鹽水洗滌并按8%(v/v)重懸。100μL的紅細胞懸液與100μL不同濃度的抗菌肽溶液混勻。混合體系放置于37℃恒溫箱中，孵育1h，取出并在4℃ 3000r/min離心10min，取上清液，使用酶標儀測570nm處吸光值。以具有溶血活性的抗菌肽Melittin(蜂毒素)作為陽性對照。對照組:1:0.1%TritionX－100 100μL; 2:15μL水加生理鹽水補齊至100μL。溶血百分比值按下式計算:溶血(%)=(抗菌肽組吸光值－對照組2吸光值)/(對照組1吸光值－對照組2吸光值)×100%。

1.2.4 抗菌肽抑制腫瘤細胞Hep－G2體外增殖的活性(MTT比色法) 將人肝癌細胞Hep－G2接種于含有10%滅活的胎牛血清，青霉素100U/mL和鏈霉素100U/mL的RPMI1640培養液中，于37℃，5%CO2飽和濕度下培養至對數生長期，0.25%胰酶消化，用1640完全制備細胞懸液5×104CFU/mL。取100μL細胞懸液于96孔板中，培養24h。加入100μL經微孔濾膜過濾除菌的不同濃度的抗菌肽，對照組加100μL培養液，37℃，5%CO2培養24h。棄去舊液，加入100μL新培養液，同時每孔加入20μL，5g/L MTT溶液，繼續培養4h。4℃、1500r/min離心5min，棄去上清液，加入100μL二甲基亞砜，37℃放置10min，待晶體溶解完全后，用酶標儀于570nm處測OD值。以抗菌肽Magainin 2作為陽性對照。細胞存活率(%)=抗菌肽組OD值/對照組OD值×100%。

1.2.5 衍生肽結合脂多糖(LPS)中和內毒素的活性方法按顯色基質鱟試劑盒說明書，略作修改，簡述如下:在置于冰浴中的各試管中加入0.1mL的鱟試劑溶液，依次加入10μL 1EU/mL的內毒素母液及10μL不同濃度的抗菌肽BF2－A/B，補加80μL內毒素檢測用水，混勻并在37℃孵育45min。各管加入顯色基質溶液0.1mL，混勻，再置于37℃孵育6min。取出置于冰浴中，各管均加入0.5mL反應終止液(鹽酸+偶氮化試劑1)，使反應終止并開始染色。依次加入偶氮化溶液2、3號各0.5mL于試管中，混勻，然后靜置5min，用分光光度計于波長545nm處測吸光度。陽性對照組:加入10μL 1EU/mL的內毒素母液，再補加90μL檢測用水。內毒素中和率(%)=(陽性組吸光值－抗菌肽組吸光值)/陽性組吸光值×100%。

1.2.6 衍生肽抵抗不同蛋白酶水解的能力 用濃度為1mg/mL的胰蛋白酶、胃蛋白酶、蛋白酶K于37℃下分別處理抗菌肽不同時間后，取100μL置于96孔培養板中，然后加入100μL的待測菌液，抗菌肽濃度為5倍MIC。對照組為未加酶處理抗菌肽100μL，37℃培養3h。利用Hultmark改進法［7］測抗菌肽對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抗菌活力。

2 結果與分析

2.1 抗菌肽BF2-A/B的抗菌活性檢測

衍生肽BF2－A/B的抗菌活性用最低抑菌濃度來表示，結果如表1所示。總體上來看，經過重新設計過的抗菌肽BF2－B無論對G+菌還是G－菌的抗菌活性要比其母肽BF2－A更強。而且，這兩個衍生肽對革蘭氏陽性菌的抑菌活性普遍要比革蘭氏陰性菌強，BF2－B尤其明顯。但對真菌的抑菌活性，總體上BF2－B又不如BF2－A強，這可能與它們對抑制細菌和真菌活性的機理不同有關。

2.2 抗菌肽對細菌的抑菌曲線

我們選用大腸桿菌和金黃色葡萄球菌作為G－、G+菌的代表，考察抗菌肽BF2－A/B對細菌的抑制曲線，結果如圖1所示。當抗菌肽加入到菌懸液后，都能抑殺大腸桿菌和金黃色葡萄球菌，但其抑菌活性卻不一樣。無論是高濃度(10μg/mL)還是低濃度(5μg/mL)，BF2－A所導致的細菌死亡均是一個非常緩慢的過程，而BF2－B的抑菌過程迅速劇烈，BF2－B明顯強于BF2－A，并且5μg/mL BF2－B的抑菌活性比10μg/mL的BF2－A還強。雖然濃度從5μg/mL增加至10μg/mL，但BF2－A的抑菌活性并沒有明顯的增強，而濃度的提高對BF2－B的抗菌活性的增強則有非常顯著的影響。這些現象說明，抗菌肽BF2－B對細菌的殺傷活性可能與它的劑量有關，而BF2－A則不是一個明顯的濃度依賴性的抗菌肽。同時說明，BF2－A/B兩者在抑殺細菌的機理上，可能會有所不同。對比大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌曲線，兩個肽對這兩種代表菌的抑菌特性沒有顯示出明顯的不同，說明BF2－A/B對G+、G－菌的抑菌機理可能是一樣的。

圖1 抗菌肽BF2－A/B對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌曲線

2.3 抗菌肽體外溶血活性

隨后我們考察了抗菌肽BF2－A/B在不同濃度下，對小鼠紅血球的溶血率，見表2。即使在10倍MIC濃度下，BF2－A/B都沒有溶血活性，只有在80μg/mL的濃度下，BF2－B才顯示出輕微的溶血率。蜂毒素Melittin是一個分離自蜜蜂毒液的陽離子抗菌肽，它是以破壞細菌細胞膜的方式來抑菌的，具有溶血活性。從表2中可以看出在高于20μg/mL時，其就能導致完全的溶血。這個結果說明，BF2－A/B對哺乳動物細胞幾乎沒有細胞毒性，很適合開發成抗菌藥物。

表2 抗菌肽BF2－A/B體外溶血活性

2.4 抗菌肽抑腫瘤細胞活性

衍生肽BF2－A/B處理后的腫瘤細胞存活率用標準的MTT方法來檢測。抗菌肽Magainin 2是一個具有抑腫瘤活性但沒有溶血活性的肽，如圖2所示，當Magainin 2濃度高于20μg/mL后，細胞存活率急劇下降。在低于100μg/mL濃度時，BF2－A幾乎沒有抑腫瘤活性，BF2－B也只是在高于50μg/mL后，才顯示出了輕微的抑腫瘤活性，在100μg/mL時，可達到大約20%的抑制率。

2.5 衍生肽中和內毒素的活性

革蘭氏陰性菌的細胞外膜的外單層上分布著大分子的醣脂類物質——脂多糖。在殺傷細菌的過程中，抗菌肽必須要和這層外膜相互作用。陰離子的脂多糖是細胞外膜的外側唯一的脂質種類，陽離子抗菌肽與細菌最初的相互作用是經過脂多糖來結合的。脂多糖是內毒素的首要成分，因此與脂多糖的結合可以用內毒素的中和作用來檢測。肽對內毒素不同的中和能力代表了與脂多糖相對結合親和力。如表3所示，兩個肽都顯示出了對脂多糖相對不同的親和性。在相同濃度下，BF2－B內毒素中和率比BF2－A高，則它和脂多糖的親和結合能力就比較強，這也許是由于它攜帶了比BF2－A更多的正電荷。隨著濃度不斷地提高，兩個肽與脂多糖的結合親和力也越強。抗菌肽對內毒素的中和能力被認為貢獻了部分的抗菌活性，因此，這解釋了擁有與脂多糖較高親和能力的BF2－B的抗菌活性之所以比BF2－A強的原因;同時這樣的結果也說明靜電相互作用在殺菌過程中是相當重要的。

圖2 抗菌肽BF2－A/B的抑腫瘤活性

表3 抗菌肽BF2－A/B與脂多糖的結合親和性

2.6 衍生肽抵抗不同蛋白酶水解的能力

2.6.1 對胰蛋白酶穩定性 胰蛋白酶是專一性強的常用蛋白酶，其水解位點是Lys或Arg的羧基端肽鍵，抗菌肽BF2－A/B經該酶處理20min后，抗菌活性立即下降，此后抗菌活性基本不變。造成這種現象的原因可能由于:兩個肽的分子中盡管含有Lys或Arg，可能在與細菌作用時，其空間構象發生改變，有些肽的堿性氨基酸與細胞外壁結合，胰蛋白酶不易于作用其上，因此還體現出一定的活性;或者雖然被胰蛋白酶水解去除一兩個氨基酸，但剩下的片段仍然具有不完全的抗菌活性。

圖3 胰蛋白酶對抗菌肽抗菌活性影響

2.6.2 對胃蛋白酶穩定性 胃蛋白酶的專一性不如胰蛋白酶，它斷裂Phe、Trp、Tyr等疏水氨基酸的羧基端肽鍵，兩個肽都含有Phe，隨著胃蛋白酶作用時間的延長，抗菌活性持續下降，但抗菌活性并沒有完全喪失，下降幅度不大，表明抗菌肽對胃蛋白酶具有一定的抵抗力。

2.6.3 對蛋白酶K的穩定性 蛋白酶K屬于非專一性的水解酶，可水解任何蛋白質的肽鍵，兩個抗菌肽隨著酶作用時間的延長，抗菌活性顯著下降，60min后，兩個肽已經基本失去抗菌活性，說明抗菌肽對蛋白酶K的作用不穩定。

圖4 胃蛋白酶對抗菌肽抗菌活性影響

圖5 蛋白酶K對抗菌肽抗菌活性影響

3 結論

衍生肽BF2－A/B都有很強的廣譜抗菌活性，BF2－B對細菌的抑菌活性普遍強于BF2－A。BF2－B殺菌過程迅速劇烈，BF2－A則非常緩慢。濃度的提高對BF2－A的活性沒有明顯的影響，而BF2－B是個濃度依賴性的肽。兩個肽均沒有體外溶血活性，而且BF2－A幾乎沒有抑腫瘤活性，但BF2－B在 100μg/mL時，能抑制大約20%的腫瘤細胞生長。BF2－A/B都能與脂多糖親和結合從而中和內毒素，BF2－B親和結合脂多糖的能力強于BF2－A。BF2－A/B經胃蛋白酶和胰蛋白酶處理后，抗菌活力都略有下降，而經蛋白酶K處理一段時間后，就完全喪失了抗菌活性。

［1］Boman HG，Nilsson I，Rasmuson B.Inducible antibacterial defense system in Drosophial［J］.Nature，1972，237:232－235.

［2］顧莉娟，吳健偉，蘇曉慶，等.抗菌肽的研究進展［J］.中國生化藥物雜志，2006，27(6):282－286.

［3］Park CB，Kim MS，Kim SC.A novel antimicrobial peptides from bufo bufo gargarizans［J］.Biochem Biophys Res Commun，1996，218:408－413.

［4］Park CB，Yi KS，Matsuzaki K，et al.Structure－activity analysis of buforinⅡ，a histone H2A－derived antimicrobial peptide:The proline hinge is responsible for the cell－penetrating ability of buforinⅡ［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2000，97:8245－8250.

［5］Hao G，Shi YH，Tang YL，et al.The membrane action mechanism of analogs of the antimicrobial peptide Buforin 2［J］. Peptides，2009，30:1421－1427.

［6］Hao G，Shi YH，Tang YL，et al.Design and analysis of structure－activity relationship of novel antimicrobial peptides derived from the conserved sequence of cecropin［J］.J Pept Sci，2008，14:290－298.

［7］Hultmark D，Steiner H，Rasmuson T，et al.Purification and properties of three inducible bactericidal proteins from hemolymph of immunized pupae of Hyalophora cecropia［J］.Eur J Biochem，1980，106:7－16.

Study on biological activity on the analogs of the antimicrobial peptide BuforinⅡ

HAO Gang1，LE Guo－wei2，SHI Yong－hui2，TANG Jun－ni1
(1.College of Life Science and Technology，Southwest University for Nationalities，Chengdu 610041，China; 2.School of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China)

The biological activities of antimicrobial peptides BF2－A/B had been studied.Both peptides showed powerful antimicrobial activities against a broad spectrum of microorganisms.The activity against bacteria of BF2－B was stronger than that of BF2－A.They didn’t display hemolytic activity.BF2－A was practically non－toxic，moreover，BF2－B exhibited about 20%of cytotoxicity at 100μg/mL.Both peptides could bind to lipopoysaccharide with relatively different affinities.BF2－B exhibited a higher binding affinity for LPS than BF2－A.After the treatment by pepsin and trypsin，the antimicrobial activities of BF2－A/B only decreased slightly.However，after the treatment by proteinase K for a while，BF2－A/B completely lost their activities.

antimicrobial peptide;BuforinⅡ;analog;biological activity

TS201.2+1

A

1002－0306(2011)12－0132－04

隨著上世紀七十年代瑞典科學家Boman等［1］在天蠶血淋巴中首次發現抗菌多肽，人們相繼在兩棲動物、昆蟲、魚類、哺乳動物等各種生物中都發現了大量的抗菌肽。抗菌肽不僅對細菌和真菌有廣譜抗性，而且還能有效抑殺病毒、寄生蟲，抑制腫瘤細胞生長，因此在醫藥、食品工業、畜牧業和農業領域具有廣闊的應用前景［2］。抗菌肽BuforinⅡ是韓國學者Park等人［3］從亞洲蟾蜍的胃組織中分離純化的有21個殘基的抗菌肽。Park等人在研究BuforinⅡ的構效關系時，在其N－端截去了4個冗余殘基后產生了一個衍生肽，它的抑菌活性比BuforinⅡ還要強［4］。在本實驗室的前期研究中，我們將此衍生肽命名為BF2－A (RAGLQFPVGRVHRLLRK)，并在其結構特征基礎上，設計并化學合成了一個新的衍生肽，命名為BF2－B (RAGLQFPLGRLLRRLLRRLLR)［5］。本文研究了這兩個衍生肽的抗菌活性和抑菌曲線，體外溶血活性，體外抑制腫瘤細胞增殖的活性，結合脂多糖的活性，以及抵抗各種蛋白酶水解的能力。

2010－09－10

郝剛(1978－)男，博士，主要從事抗菌肽設計與抑菌機理的研究。

國家自然科學基金(31071515);西南民族大學人才引進項目(2010RC04)。