白藜蘆醇對線蟲壽命的影響及分子機理研究

王 芳，田仕夫，鄔樹偉，劉常金

(天津科技大學食品工程與生物技術學院，天津300457)

白藜蘆醇對線蟲壽命的影響及分子機理研究

王 芳，田仕夫+，鄔樹偉，劉常金*

(天津科技大學食品工程與生物技術學院，天津300457)

目的:研究白藜蘆醇延長壽命的效果和抗衰老的分子機理。方法:以模式生物秀麗線蟲為材料，觀察在正常(25℃)和熱應激(35℃)培養條件下，空白對照組和終濃度為50mg/L和100mg/L的白藜蘆醇藥物組對秀麗線蟲壽命的影響;用半定量RT-PCR方法對衰老相關基因Abnormal dauer formation protein 16(daf-16)、superoxide dismutase-3 (sod-3)、heat shock protein-16.2(hsp-16.2)的表達情況進行了分析。結果:在兩種培養條件下，與空白組比較，藥物組的線蟲壽命都顯著延長，且100mg/L終濃度白藜蘆醇對線蟲壽命延長作用更顯著;藥物組衰老相關基因表達上調。結論:白藜蘆醇通過上調daf-16、sod-3和hsp-16.2基因的表達實現對秀麗線蟲壽命的延長，研究結果為白藜蘆醇抗衰老機制研究提供重要參考。

白藜蘆醇，秀麗線蟲，壽命相關基因，半定量RT-PCR

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

白藜蘆醇 天津市尖峰天然產物研究開發有限公司惠贈;5-氟脲嘧啶(5-Fu) 美國sigma公司;羥丙基環糊精 廣州泰龍生化公司;TRIZOL試劑 美國Invitrogen公司;逆轉錄酶及Taq DNA聚合酶 北京全式金生物技術有限公司;核酸染料(gelview) 北京百泰克生物技術有限公司;大腸桿菌OP50 由美國線蟲中心CGC提供;野生型線蟲N2 由北京生命科學研究所惠贈。

凝膠成像分析儀及普通PCR儀(MyCycler 170-9703) 美國Bio-Rad公司;移液器、小型離心機德國Eppendorf公司;電泳儀 北京六一儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 白藜蘆醇的環糊精包埋 白藜蘆醇是非水溶的天然產物。羥丙基環糊精可溶于水，是很好的包埋劑。經本實驗室研究表明，可用羥丙基—環糊精以一定比例對白藜蘆醇進行包埋。

在40mL無水乙醇中緩慢加入2g白藜蘆醇，并不斷攪拌至白藜蘆醇全部溶解。向30mL蒸餾水中緩慢加入20g環糊精并不斷攪拌至環糊精全部溶解。再將溶解有環糊精的30mL液體放入溫度設為37℃的恒溫加熱磁力攪拌器上。將白藜蘆醇的乙醇溶液以3mL/min的速率逐滴加入到不斷攪拌的環糊精水溶液中。50℃、80r/min真空旋蒸至酒精完全揮發，時間不宜太長，防止白藜蘆醇氧化。待白藜蘆醇的乙醇溶液完全加入到環糊精水溶液中后，避光保存于4℃冰箱中。

1.2.2 線蟲壽命觀察

1.2.2.1 線蟲的喂養 線蟲的培養使用線蟲標準培養基(NGM)，根據文獻［3］配制。E.coli OP50用作線蟲的食物。培養溫度為25℃。

1.2.2.2 線蟲的同期化 當需要同期化線蟲數目較多時，采取高氯酸鈉漂白法。準備孕蟲生長板2～3個。

a.用無菌蒸餾水沖洗孕蟲生長板，將含孕蟲的蒸餾水吸入1.5mL離心管中，1500×g離心3min，棄去上清液。

b.加入1mL新配同期化漂白液，室溫下劇烈震蕩3min，以將成蟲蟲體腐蝕。

c.2000×g離心3min，棄去上清。b與c步驟總時間不能超過7min，否則將損傷蟲卵。

d.用無菌蒸餾水將沉淀重懸，混合后1000×g離心3min，棄去上清。

e.將沉淀混勻，取NGM培養皿，將重懸后的沉淀接種至培養皿中，約200μL/板接種。

附：線蟲同期化試劑(5mL)：NaOH(0.5mol/L) 0.5mL，NaClO(8%～9%)0.5 mL，H2O 4.0mL。

1.2.2.3 線蟲壽命觀察 實驗設定空白對照組(白藜蘆醇終濃度為0mg/L)、低濃度藥物劑量組(白藜蘆醇終濃度為50mg/L)、高濃度藥物劑量組(白藜蘆醇終濃度為100mg/L)，每組90條線蟲，每平板30條。

a.正常培養溫度(25℃)下線蟲壽命的觀察：把白藜蘆醇加入到 NGM培養基中配成不同終濃度(50mg/L、100mg/L)的培養液，然后將 E.Coli OP50涂布到配制好的NGM培養基上。使用次氯酸鈉溶液對秀麗線蟲進行同步化，把新孵出的L1期線蟲在涂有E.coli OP50的NGM培養皿中進行培養。當線蟲進入產卵期(第 3.5d)時，把線蟲轉移至加有400μmol/L FUDR的培養基，以抑制卵的孵出。在25℃的培養箱中培養。在從加藥處理開始的10d內，每隔一天把線蟲轉移至新配制的培養皿中，10d后不用藥物處理。在10d中，每隔一天換一次培養基，線蟲壽命統計從轉板的第二天開始，每天詳細記錄線蟲死亡數。數量統計采用雙盲(double-blind)統計方法。

b.熱應激(35℃)條件下線蟲壽命的觀察：對照組不用藥物處理，藥物處理組分別用終濃度為50mg/L和100mg/L的培養基預處理處于L1期的線蟲48h，然后轉移到35℃的培養箱中進行熱應激。每半小時計數死亡蟲子的數目并做詳細記錄。數據統計采用雙盲的統計方法。

1.2.3 線蟲壽命相關基因的表達分析

1.2.3.1 線蟲RNA提取 線蟲同期化孵出幼蟲后，繼續在平板上培養5d，采用TRIZOL法提取25℃條件下空白對照組(0mg/L)和壽命延長最顯著的藥物實驗組(100mg/L)總RNA，瓊脂糖電泳確定其完整性。提取的RNA通過直接用作模板，用ama-1引物做PCR進行純度檢驗，如無擴增條帶則認為無DNA污染，如有擴增條帶則進一步用RNase free的DNaseI消化，確定無DNA污染后再用作RT-PCR模板。

1.2.3.2 PCR反應條件及引物 PCR反應條件：94℃，4min(1個循環);94℃，30s，55℃(可變)，30s，72℃，50s(30個循環);72℃，10min。相關引物如下，由上海生物工程有限公司合成。

daf-16：TTCCCCTTTCTCTCGTCTAATTC(上游)和CATCATCATCATACAGTCTCAAA(下游)。

sod-3：AGTAGTAGGCGTGCTCCCAA(上游)和TGTGCTGACACCGAAATGTT(下游)。

hsp-16.2：CGTCGAAGAGAAATCTGCTGAA(上游)和TGCAGCGAACAATACTGTAATTTATG(下游)。

ama-1：GGACGACGTGTTCCTACGAT(上游)和GTTGGCGAATAACTGGGAGA(下游)。

1.2.4 數據處理工具與統計方法 壽命實驗及應激實驗的數據使用SPSS 16.0的Kalpan-Meir存活曲線分析程序分析。加藥處理組和對照組之間的比較使用SPSS 16.0的Kaplan-Meier Log-rank兩兩比較程序分析，由此計算出p值來表示其顯著性。如果p＜0.05則表示有顯著差異;p＜0.01表示差異極顯著。

2 結果與討論

2.1 不同濃度白藜蘆醇對線蟲壽命的影響

2.1.1 正常培養條件下(25℃)白藜蘆醇對線蟲壽命的影響 本實驗采用環糊精包埋的白藜蘆醇，其水溶性更好，在培養基中可均勻分布，增強了數據的準確性。

在正常培養條件下(25℃)觀察統計白藜蘆醇對線蟲壽命的影響，結果顯示，與空白對照組(0mg/L)相比，低劑量藥物組(50mg/L)線蟲平均壽命提高了14.06%(p＜0.01)，高劑量藥物組(100mg/L)線蟲平均壽命提高了22.10%(p=0.001)，藥物組的最大壽命也長于對照組。對線蟲全程生存情況做生長曲線，兩種劑量的白藜蘆醇均能使曲線右移，而且高劑量組對壽命的延長效果好于低劑量組(見圖1)，可見，在一定濃度范圍內，白藜蘆醇對線蟲壽命的影響具有劑量依賴性。

圖1 25℃培養條件下線蟲生長曲線

2.1.2 熱應激條件下(35℃)白藜蘆醇對線蟲壽命的影響 在熱應激條件下(35℃)觀察統計白藜蘆醇對線蟲壽命的影響，結果表明，與空白對照組(0mg/L)相比，低劑量藥物組(50mg/L)線蟲壽命提高了11.87%(p＜0.05);高劑量藥物組(100mg/L)線蟲壽命提高了22.64%(p＜0.05)，藥物組的最大壽命也長于對照組。對線蟲全程生存情況做生長曲線，兩種劑量的白藜蘆醇均能使曲線右移，且高劑量組(100mg/L)延長線蟲壽命效果更為明顯(見圖2)。可見，在熱應激條件下，在一定濃度范圍內，白藜蘆醇對線蟲壽命的延長也具有劑量依賴性。

圖2 35℃培養條件下線蟲生長曲線

2.2 白藜蘆醇對線蟲衰老相關基因的影響

線蟲用100mg/L的白藜蘆醇喂食5d后，線蟲內衰老相關基因發生變化，通過半定量RT-PCR法分析其變化情況。以管家基因ama-1為內參，與空白對照組相比，高劑量藥物組的基因daf-16、sod-3、hsp-16.2的表達都明顯上調(見圖3)。

daf-16是胰島素/胰島素樣生長因子-1(Insulin/ IGF-1)信號通路中編碼轉錄因子FOXO的基因，它被磷酸化后不能進入細胞核，未被磷酸化的形式能向細胞核內轉移，實現對壽命及免疫的調控［4］。當面臨應激時，JNK-1促進daf-16向核內轉移，從而激活相關基因并提高線蟲抵抗環境應激的能力［4］。研究表明sod-3和hsp-16.2是位于daf-16下游的效應因子，作為脅迫感應器延長線蟲壽命［5-6］。sod-3是編碼超氧化物歧化酶(SOD)的基因，SOD能清除生命體內多余的超氧化物和自由基，過表達SOD可以減少氧化損傷并延長壽命［7］。hsp-16.2是一種分子伴侶，可以幫助蛋白正確折疊為天然構象，對壽命起到正調節作用［8］。

圖3 線蟲衰老相關基因的表達分析

3 結論

本研究利用模式生物線蟲研究了白藜蘆醇的抗衰老效果及其分子機理。研究發現，無論在正常條件還是熱應激條件下，白藜蘆醇對線蟲均有顯著的延長壽命的效果。基因表達分析實驗表明，高劑量藥物組的Insulin/IGF-1信號通路上游的轉錄因子daf-16表達上調，其下游的sod-3和hsp-16.2的表達量也相應增加。由此推測，白藜蘆醇是通過上調Insulin/IGF-1信號通路中相關基因，提高線蟲抵抗環境應激的能力從而延緩線蟲衰老的。

該研究為白藜蘆醇的應用提供了理論依據，為其抗衰老機理的研究提供了新內容。

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The effect of resveratrol on Caenorhabditis elegans lifespan and its molecular mechanism

WANG Fang，TIAN Shi-fu+，WU Shu-wei，LIU Chang-jin*
(College of Food Engineering and Biotechnology，Tianjin University of Science and Technology，Tianjin 300457，China)

Objective:To study the extending longevity effect and anti-senescence molecular mechanism of resveratrol.Method:The lifespan assay was carried out on model organism Caenorhabditis elegans(C.elegans) which dieted resveratrol with final concentration 50mg/L and 100mg/L under normal culture conditions(25℃)and under heat stress(35℃)，respectively.Semi-quantitative RT-PCR was used to analyze the expression of agingassociated genes such as daf-16，sod-3 and hsp-16.2.Result:Under the two kinds of culture conditions the C.elegans fed resveratrol was shown to extend lifespan compared to the control without resveratrol uptake. Furthermore，the resveratrol with final concentration 100mg/L had more obvious longevity-extending effect.The expression of aging-associated genes was up-regulated.Conclusion:The results suggested that resveratrol significantly extended the lifespan of C.elegans through up-regulating some genes’expression such as daf-16，sod-3 and hsp-16.2 which would provide important reference for antiaging research of resveratrol.

resveratrol;Caenorhabditis elegans;aging-associated genes;semi-quantitative RT-PCR

TS201.2

A

1002-0306(2011)12-0126-03

白藜蘆醇的抗衰老、抗氧化生理活性已得到了廣泛認可［1］，但對于其分子機理的研究較少，目前研究認為：白藜蘆醇作為限食(Caloric Restriction)的一種模擬物，可以通過與限食類似的機理延長模式動物壽命的作用。如Wood等發現［2］，100μmol/L的白藜蘆醇可模擬限食作用來激活基因SIR-2.1，從而延長野生型線蟲的壽命達14%。而利用野生型Canton-S果蠅進行的壽命實驗中，100μmol/L的白藜蘆醇可延長果蠅的壽命達29%。對于白藜蘆醇是否還具有其它抗衰老的分子機理有待進一步研究，本實驗通過研究白藜蘆醇對線蟲在正常條件下(25℃)和熱應激(35℃)條件下的壽命影響以及相關基因表達分析，探索了白藜蘆醇對秀麗線蟲壽命影響的分子機理，為深入研究其作用機制提供重要理論參考。

2010-10-27 *通訊聯系人，+為并列第一作者。

王芳(1975-)，女，博士，講師，研究方向:植物基因工程與分子生物學。田仕夫(1984-)，男，在讀碩士，研究方向:生物化學與分子生物學。

天津科技大學實驗室開放基金項目資助。