貞芪酪蛋白多肽復合物抗腫瘤機制的研究

張 笠，張延英 ，吳建軍，劉 潤

（1.甘肅省第二人民醫院，甘肅 蘭州 730000；2.甘肅省中醫學院，甘肅 蘭州 730000）

貞芪酪蛋白多肽復合物抗腫瘤機制的研究

張 笠1，張延英2，吳建軍2，劉 潤2

（1.甘肅省第二人民醫院，甘肅 蘭州 730000；2.甘肅省中醫學院，甘肅 蘭州 730000）

目的通過體外實驗探索貞芪酪蛋白多肽復合物抗腫瘤機制。方法用貞芪酪蛋白多肽復合物給小鼠灌胃，觀察藥物對大鼠免疫功能的影響；同時用貞芪酪蛋白多肽復合物給大鼠灌胃，制備藥物血清，在體外觀察貞芪酪蛋白多肽復合物對K562細胞的抑制作用。結果貞芪酪蛋白多肽復合物對小鼠Mф表面Ia抗原表達陽性率與正常對照組對比P<0.05，3種濃度的貞芪酪蛋白肽血清中以30%貞芪酪蛋白肽血清抑制率最高。結論貞芪酪蛋白多肽復合物能夠促進小鼠Mф細胞系統Ⅰ類抗原表達，貞芪酪蛋白肽血清對K562細胞體外增殖有抑制作用。

貞芪酪蛋白多肽復合物；抗腫瘤機制；免疫功能

貞芪酪蛋白肽是根據“扶正培本、扶正祛邪”的傳統醫學理論，以黃芪（Astragalus Membranaceus，AM）、女貞子（Ligustrum Lucidum，LL）及酪蛋白復合多肽等組方經特定制劑工藝研制而成，是在長期醫療實踐中篩選的一種臨床抗癌驗方。該方劑符合中醫組方原則，是針對惡性腫瘤的發病機制而形成的。酪蛋白復合多肽在保健品、醫藥等多領域起著特殊的作用。近十多年來，肽在人體中的作用已引起科學界的高度重視，大量研究結果表明，蛋白質攝入后，并不能完全水解成氨基酸，而是大部分以肽的形式被吸收；同時發現，多肽被吸收的速度比同組成的氨基酸要快[1]，酪蛋白是牛奶中的主要組成成分，它是一組蛋白的磷酸鹽，由4種成分組成：αs1-、αs2-、β-和κ-酪蛋白。酪蛋白肽具有抗誘變、免疫調節、延緩衰老、抗過敏性、抗高血壓、促進激素分泌和細胞繁殖、保護表皮細胞、防止黑色素沉淀等多種功效[2～4]。本研究應用傳統醫學理論將酪蛋白與黃芪、女貞子配制成復合物，對其抗腫瘤機制進行探索。

1 材料與方法

1.1 動物與細胞

昆明種小鼠50只，SPF級，體重18～20 g，SD雄性大鼠30只，體重150～200 g，SPF級，購自甘肅中醫學院實驗動物中心，制備藥物血清用。制備藥物血清的動物實驗在甘肅中醫學院SPF級動物實驗室進行；人白血病細胞株K562由蘭州大學基礎醫學院中西醫結合研究所饋贈，用含10%小牛血清和雙抗的RPMI-1640培養液，在37℃、5%CO2的細胞培養箱中培養，每2～3天傳代一次。

1.2 藥物與試劑

貞芪酪蛋白復合肽由甘肅中醫學院實驗中心配制。臨用時用蒸餾水稀釋成所需濃度（實驗所用劑量均以生藥計）。小牛血清（Fetal Calf Serum，FCS）購于杭州四季青公司，RPMI-1640培養基干粉為Gibco公司產品，噻唑蘭（MTT）由華美生物工程公司提供，胰蛋白酶由美國Gtbcg公司提供，注射用卡鉑批號20100112，江蘇恒瑞藥業股份有限公司產品。其余試劑均為國產分析純。

1.3 實驗分組

用貞芪酪蛋白多肽復合物給SPF級小鼠和大鼠灌胃，分為高劑量組（灌胃貞芪酪蛋白多肽復合物8g/kg·d）、中劑量組（灌胃貞芪酪蛋白多肽復合物4g/kg·d）、低劑量組（灌胃貞芪酪蛋白多肽復合物2g/kg·d）以及正常對照組（生理鹽水）、貞芪扶正顆粒組（灌胃貞芪酪蛋白多肽復合物15g/kg·d）共5個組；體外貞芪酪蛋白多肽復合物藥物血清試驗血清濃度分別稀釋為10%、20%、30%和K562細胞對照組以及正常對照組這5個組。

1.4 統計方法

實驗數據用mean±sd表示，數據統計多組之間用多因素方差分析，兩兩比較用SNK法，檢驗水準設為0.05。

2 實驗結果

2.1 貞芪酪蛋白多肽復合物對小鼠免疫功能的影響

將小鼠分為以下5組：正常對照組（灌胃生理鹽水）、貞芪扶正顆粒組（灌胃貞芪酪蛋白多肽復合物15g/kg·d）、低劑量組（灌胃貞芪酪蛋白多肽復合物2g/kg·d）、中劑量組（灌胃貞芪酪蛋白多肽復合物4g/kg·d）、高劑量組（灌胃貞芪酪蛋白多肽復合物8g/kg·d），每組10只小鼠，用以上劑量給小鼠灌胃4 d后采血，分離血清測定Mφ表面Ia抗原表達的陽性率，并解剖小鼠分離其脾臟與胸腺，稱重后計算其胸腺指數與脾臟指數（見表 1、表 2）。

表1 貞芪酪蛋白多肽復合物對小鼠Mφ表面Ia抗原表達陽性率的影響（mean±sd）

表2 貞芪酪蛋白多肽復合物對小鼠免疫器官重量的影響（mean±sd）

2.2 貞芪酪蛋白多肽復合物藥物血清對K562細胞增殖的影響

將大鼠分為以下5組：正常對照組（灌胃生理鹽水）、貞芪扶正顆粒組（灌胃貞芪酪蛋白多肽復合物15g/kg·d）、低劑量組（灌胃貞芪酪蛋白多肽復合物2g/kg·d）、中劑量組（灌胃貞芪酪蛋白多肽復合物4g/kg·d）、高劑量組（灌胃貞芪酪蛋白多肽復合物8g/kg·d）。每組10只，用以上劑量給大鼠灌胃8d后采血，在恒溫4℃狀態靜置3 h，以1 500 r/min離心，然后分離血清，在56℃靜置30 min滅活補體，以0.22 nm濾膜抽濾除菌。然后將藥物血清濃度分別稀釋為10%、20%、30%和K562細胞對照組以及正常對照組共5個組進行MTT實驗，結果見表3。

表3 各組K562細胞增殖情況比較（n=10，±s）

表3 各組K562細胞增殖情況比較（n=10，±s）

注：與對照組對比，▲P<0.05，▲▲P<0.01

組別 吸光率A值 抑制率（%）K562細胞對照組正常對照組藥物血清組10%藥物血清組20%藥物血清組30%-1.02 38.52 57.09 68.35±0.04±0.03▲±0.04▲▲±0.02▲▲±0.04▲▲0.81 0.86 0.53 0.43 0.36

由表3可見，生理鹽水血清對K562細胞生長無抵制作用，3種濃度的貞芪酪蛋白肽血清中以30%貞芪酪蛋白肽血清抑制率最高。說明貞芪酪蛋白肽血清濃度為10%、20%、30%時其抑制率有劑量反應依賴關系。

3 討論

腫瘤的發生是多種基因的異常表達導致細胞凋亡的結果，因此，有效控制腫瘤細胞的異常凋亡是治療腫瘤的有效途徑。近年來，從傳統醫學中發掘新的抗癌藥物用于腫瘤治療已成為趨勢，中藥的抗癌效應正受到越來越多的關注。惡性腫瘤屬于中醫學癥瘕、積聚、噎嗝、虛勞、乳巖等范疇，其病機主要是瘀血內停、痰濕停聚、氣血陰陽虧虛，治則主要為活血化瘀、燥濕化痰、清熱解毒、扶正固本、以毒攻毒等。中藥是我國治療腫瘤的傳統方法，中藥治療疾病的主要方法是復方，因中藥復方是一個有機整體，可互增療效，以最大限度地治療疾病。

本研究發現，貞芪酪蛋白多肽復合物能夠促進小鼠Mφ細胞系統Ⅰ類抗原表達，說明貞芪酪蛋白多肽復合物可以提高免疫功能。貞芪酪蛋白肽血清對K562細胞體外增殖的抑制作用及初步顯示的劑量反應關系進一步證明其具有抗腫瘤作用。

綜上所述，筆者認為誘導凋亡是貞芪酪蛋白肽對K562細胞體外抑制增殖作用的重要分子機制。但實驗中進一步發現，隨著貞芪酪蛋白肽血清濃度的增加，出現明顯的劑量效應，對K562細胞的抵制率有明顯增高。筆者認為這可能是由于貞芪酪蛋白肽血清濃度及作用時間不同所產生的效應差異，高濃度或長時間作用更容易導致細胞壞死而非凋亡；相對低濃度和短時間作用更易引起細胞內部結構和生物學功能的改變，如細胞凋亡，而非細胞整體結構和功能的喪失，這一點對于指導臨床用藥具有重要意義。

[1]龐廣昌，王秋韞.生物活性肽的研究進展理論基礎與展望[J].食品科學，2001，2（26）：45～47.

[2]汪永鋒，張延英.貞芪酪蛋白肽對大鼠巨噬細胞功能的調節作用[J].中醫研究，2006，19（3）：22～23.

[3]張延英，朱建坤，吳建軍，等.貞芪酪蛋白肽藥物血清誘導Bel 7402細胞分化的體外實驗研究[J].中國實驗方劑學雜志，2008，14（9）：47～49.

[4]高莉，任潤珍，吳建軍，等.貞芪酪蛋白肽復合物血清對A549細胞抑制及其作用機制研究[J].中國醫藥與臨床研究，2009，15（6）：1～4.

G424.31

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1671-1246（2011）02-0100-02