超臨界體系酶法催化甘油解制備甘油二酯的研究

任運(yùn)宏，孫 博，劉 晶，江連洲，于殿宇

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江哈爾濱150030）

超臨界體系酶法催化甘油解制備甘油二酯的研究

任運(yùn)宏，孫 博，劉 晶，江連洲，于殿宇*

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江哈爾濱150030）

對(duì)在CO2超臨界體系酶法催化甘油解反應(yīng)制備甘油二酯進(jìn)行研究，考察了底物大豆一級(jí)油/甘油的摩爾比、反應(yīng)溫度、加酶量、加水量、時(shí)間和攪拌速度等因素對(duì)甘油二酯含量的影響。通過單因素與正交實(shí)驗(yàn)，確定了最優(yōu)工藝條件為：大豆一級(jí)油與甘油摩爾比2∶1，反應(yīng)溫度65℃，加酶量2.5%，甘油含水量1%，反應(yīng)時(shí)間7h，攪拌速度120r/min，得到反應(yīng)產(chǎn)物中甘油二酯含量為70.2%，其中1，3-甘油二酯含量達(dá)56.2%。與常規(guī)甘油解相比，甘油二酯含量要高出7%左右，其中1,3-甘油二酯含量要高出5%左右，并且，時(shí)間減少2h左右。

大豆油，甘油解，脂肪酶Lipozyme RMIM，CO2超臨界，甘油二酯

隨著人們生活水平的提高、不良生活習(xí)慣的形成，肥胖癥、心血管疾病、脂肪肝等富貴病越來越普遍，目前已嚴(yán)重威脅人類的健康。甘油二酯不僅能改善食品風(fēng)味，延長儲(chǔ)存期，而且是功能食品的主要添加劑，能減少體內(nèi)的脂肪堆積，預(yù)防和治療高血脂及相關(guān)疾病[1-3]。甘油二酯（diglyceride，DAG，也稱甘二酯）是油脂的天然成分，是油脂代謝的中間產(chǎn)物[4]。甘油二酯安全性高，已經(jīng)通過了美國FDA認(rèn)證，是“世界公認(rèn)安全（GRAS）”的食品成分[5]。根據(jù)酰基與甘油羥基結(jié)合的位置不同，可將其分為1，2-DAG和1，3-DAG兩類[6]。從現(xiàn)有信息來看，甘油解法似乎是生產(chǎn)甘油二酯最經(jīng)濟(jì)的方法，也是目前工業(yè)上主要采用的方法[7]。當(dāng)一種流體處在高于其臨界點(diǎn)的溫度和壓力下，被稱之為超臨界流體（SCFs），它既具有與氣體相似的密度、粘度、擴(kuò)散系數(shù)等物性，又兼有與液體相近的特性，是處于氣態(tài)和液態(tài)之間的中間狀態(tài)的物質(zhì)[8]。純CO2的臨界壓力為7.39MPa，臨界溫度為31.06℃，當(dāng)反應(yīng)壓力、溫度高于臨界點(diǎn)，被稱為超臨界CO2。這是一種可壓縮的高密度流體，是通常所說的氣、液、固三態(tài)以外的第四態(tài)，超臨界CO2的分子間力很小，類似于氣體；而密度卻很大，接近于液體，是一種氣液不分的狀態(tài)，沒有相界面，也就沒有相際效應(yīng)，有助于提高反應(yīng)效率，并可大幅度節(jié)能[9]。超臨界狀態(tài)下流體CO2同時(shí)起到溶劑和催化劑的作用，由于CO2是非極性分子，可避免其它方法出現(xiàn)中毒和催化劑失活的現(xiàn)象。另外，該反應(yīng)環(huán)境下可阻止甘油解逆反應(yīng)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大豆一級(jí)油 黑龍江龍江福糧油有限公司提供；甘油 分析純，中國醫(yī)藥（集團(tuán)）上海化學(xué)試劑公司；Lipozyme RMIMNovo公司；甘油酯標(biāo)準(zhǔn)品 Sigma Chemical Company；4A型分子篩 中國醫(yī)藥（集團(tuán)）上海化學(xué)試劑公司；乙醚、石油醚、甲酸、氯仿、碘、正己烷、異丙醇等 均為分析純。

恒溫水浴鍋 天津市泰斯特儀器有限公司；高壓反應(yīng)釜 由青島科技大學(xué)于世濤教授提供；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器 鞏義市英峪高科儀器廠；LD4-2A低速離心機(jī) 北京醫(yī)用離心機(jī)廠；HPLC Waters公司。

1.2 酶催化甘油解反應(yīng)過程

將大豆一級(jí)油和經(jīng)分子篩脫水后的甘油以一定的摩爾比加入到150mL不銹鋼高壓釜中，添加一定量的脂肪酶Lipozyme RMIM快速攪拌，加入微量的水，密封高壓釜，通入CO2進(jìn)行試漏，再用CO2置換不銹鋼高壓釜中的空氣。置換完成后，在室溫條件下充入CO2，使壓力達(dá)7.5MPa，將反應(yīng)釜置于集熱式恒溫加熱磁力攪拌器中加熱，調(diào)節(jié)一定的轉(zhuǎn)速，恒溫反應(yīng)一段時(shí)間。反應(yīng)結(jié)束后，將不銹鋼高壓釜冷卻至室溫，放出氣體，打開高壓釜，取出流體物，用離心機(jī)離心分離除去催化劑，得反應(yīng)產(chǎn)物，取反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行液相測定，得出甘油二酯百分含量。反應(yīng)裝置系統(tǒng)示意圖如圖1。

圖1 反應(yīng)裝置系統(tǒng)示意圖

1.3 甘油二酯含量計(jì)算

取反應(yīng)產(chǎn)物一滴，準(zhǔn)確稱量，用1mL正己烷/異丙醇50∶1（V/V）溶解，進(jìn)樣分析。色譜條件：檢測器：Waters 2410示差折光檢測器；主機(jī)泵：Waters 515 HPLC Pump；色譜柱：No-va-Pak 3.9mm×150mm液相色譜柱；流動(dòng)相：正己烷/異丙醇為50∶1（V/V）；流速：1.0mL/min；柱箱溫度：35℃；檢測器溫度：35℃；進(jìn)樣量：20μL。

各種組分的計(jì)算采用面積歸一法。

式中：w為甘二酯的質(zhì)量分?jǐn)?shù)；m（FFA）、m（MAG）、m（DAG）和m（TAG）分別為脂肪酸、甘一酯、甘二酯和甘三酯的質(zhì)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 反應(yīng)溫度對(duì)產(chǎn)物組成變化的影響

反應(yīng)條件：底物摩爾比2∶1，甘油含水量1%，時(shí)間8h，加酶量3%，攪拌速度120r/min。研究表明，反應(yīng)溫度增加，有助于甘油解的提高；但反應(yīng)溫度過高，對(duì)酶的空間結(jié)構(gòu)和構(gòu)象有一定的影響，會(huì)降低酶活并減少酶的使用壽命，導(dǎo)致酶的反應(yīng)速度不是增大反而減小[10]。

圖2 反應(yīng)溫度對(duì)反應(yīng)體系各組分百分比的影響

由圖2可見，在體系溫度約為65℃時(shí)，甘二酯含量較高，說明此溫度較適合甘油解反應(yīng)，因此該種酶反應(yīng)較合適的溫度為65℃。

2.2 加酶量對(duì)產(chǎn)物組成變化的影響

反應(yīng)條件：底物摩爾比2∶1，甘油含水量1%，時(shí)間8h，溫度65℃，攪拌速度120r/min。加酶量的變化和反應(yīng)速度密切相關(guān)，酶量增加，甘油解的速度加快。酶促甘油解過程是一個(gè)動(dòng)力學(xué)平衡過程，加酶量的多少只對(duì)反應(yīng)的速度有影響，即對(duì)反應(yīng)達(dá)到平衡的時(shí)間有影響，而和反應(yīng)達(dá)到平衡的狀態(tài)沒有關(guān)系。

圖3 酶添加量對(duì)反應(yīng)體系中各組分百分比的影響

由圖3可見，3%的加酶量對(duì)甘油解反應(yīng)較為合適，在盡可能降低生產(chǎn)成本的同時(shí)，也保證了一定的反應(yīng)速度。

2.3 底物比對(duì)產(chǎn)物組成變化的影響

反應(yīng)條件：甘油含水量1%，加酶量3%，溫度65℃，時(shí)間8h，攪拌速度120r/min。

圖4 底物摩爾比對(duì)反應(yīng)體系中各組分百分比的影響

底物比不僅影響反應(yīng)時(shí)間也影響平衡狀態(tài)。由圖4可見，當(dāng)?shù)孜锉葹?∶1時(shí)，甘二酯的百分含量達(dá)到最大值。在此以后，體系中甘二酯含量呈下降趨勢。因此，選擇底物比為2∶1。

2.4 甘油含水量對(duì)產(chǎn)物組成變化的影響

反應(yīng)條件：底物摩爾比2∶1，加酶量3%，時(shí)間8h，溫度65℃，攪拌速度120r/min。對(duì)于酶基本水的測定和估算是比較困難的。水量增加時(shí)，使酶分子表面的水膜加厚，而反應(yīng)底物油脂是難溶于水的，因此使底物從主體溶劑擴(kuò)散到活性部位的阻力增大，不易于底物與酶的結(jié)合。

圖5 含水量對(duì)反應(yīng)體系中各組分百分比的影響

由圖5可見，甘油含水量為1%時(shí)，甘二酯百分比最高；隨著含水量的增加，甘二酯的百分比呈下降趨勢，說明甘油含水量的增加，體系的水解反應(yīng)速度加快。因此，選擇甘油含水量為1%。

2.5 反應(yīng)時(shí)間對(duì)產(chǎn)物組成變化的影響

反應(yīng)條件：底物摩爾比2∶1，甘油含水量1%，加酶量3%，溫度65℃，攪拌速度120r/min。脂肪酶所催化的甘油解反應(yīng)可分為兩步完成，在脂肪酶的催化作用下，甘三酯與甘油先醇解為甘一酯和甘二酯（由于酶中有活性水使甘三酯部分水解生成甘二酯、甘一酯和脂肪酸），然后甘一酯和甘三酯再酯交換為甘二酯[11]。

圖6 反應(yīng)時(shí)間對(duì)體系中各組分百分比的影響

由圖6可見，在反應(yīng)時(shí)間為7h以上時(shí)，體系中甘二酯含量較高。反應(yīng)時(shí)間的延長不利于經(jīng)濟(jì)效益，因此，選擇反應(yīng)時(shí)間為7h。

2.6 攪拌速度對(duì)產(chǎn)物組成變化的影響

反應(yīng)條件：底物摩爾比2∶1，甘油含水量1%，加酶量3%，溫度65℃，時(shí)間8h。適當(dāng)?shù)臄嚢杷俣葧?huì)影響多相反應(yīng)的傳質(zhì)效果，增加底物兩相在催化劑表面上的接觸，加快反應(yīng)速度。

由圖7可見，在反應(yīng)速度為120r/min時(shí)，甘二酯含量最高；當(dāng)反應(yīng)速度繼續(xù)增加時(shí)，甘二酯含量降低，過高的反應(yīng)速度可能會(huì)對(duì)固定化酶造成機(jī)械損傷，影響酶活。因此，120r/min的攪拌速度較為適合。

圖7 攪拌速度對(duì)體系中各組分百分比的影響

2.7 正交實(shí)驗(yàn)

單因素實(shí)驗(yàn)表明，時(shí)間和攪拌速度兩因素在一定范圍內(nèi)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響不大，反應(yīng)時(shí)間的延長對(duì)于產(chǎn)品生產(chǎn)周期、產(chǎn)品質(zhì)量不利，攪拌速度應(yīng)選用脂肪酶的最適作用速度即可。所以優(yōu)化實(shí)驗(yàn)中選擇反應(yīng)時(shí)間為7h，攪拌速度為120r/min，采用L9（34）正交表進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)，確定最優(yōu)底物摩爾比、含水量、溫度、加酶量等反應(yīng)條件，以得到甘二酯含量較高的成品油。

表1 正交實(shí)驗(yàn)因素水平表

表2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

從正交表中R值可知，影響體系生成甘二酯含量的順序?yàn)椋杭用噶浚镜孜锬柋龋緶囟龋炯铀俊Ｔ谶x擇加酶量時(shí)，由k值可看出，k1＜k2，差值較小，由于酶的價(jià)格較貴，考慮到工業(yè)生產(chǎn)成本的問題，取k1較適合。同時(shí)，在選擇加水量時(shí)也可從k值看出，加少量水與不加水對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響不大。因此，選擇最優(yōu)實(shí)驗(yàn)條件為A2B1C2D2。

2.8 反應(yīng)產(chǎn)物檢測

在最優(yōu)條件下，CO2超臨界體系酶法催化甘油解反應(yīng)產(chǎn)物色譜圖如圖8。保留時(shí)間在1.923、2.173、2.532、2.898、3.923、11.940min的組分分別是溶劑、甘三酯、脂肪酸、1，3-甘二酯、1，2-甘二酯、單甘脂。

圖8 反應(yīng)產(chǎn)物色譜圖

3 結(jié)論

3.1 本研究確定了在CO2超臨界體系中以大豆一級(jí)油和甘油為原料，研究以固定化脂肪酶Lipozyme RMIM催化甘油解反應(yīng)合成甘油二酯的工藝是可行的。通過單因素與正交實(shí)驗(yàn)，確定了最佳工藝條件為：大豆一級(jí)油與甘油摩爾比2∶1，反應(yīng)溫度65℃，加酶量2.5%，甘油含水量1%，反應(yīng)時(shí)間7h，攪拌速度120r/min。在此條件下，得反應(yīng)產(chǎn)物中甘油二酯含量為70.2%，其中1，3-甘油二酯含量達(dá)56.2%。

3.2 常規(guī)的甘油解生成甘油二酯含量63%左右，1，3-甘油二酯含量50%左右。CO2超臨界體系甘油解與常規(guī)甘油解相比，甘油二酯含量要高出7%左右，其中1，3-甘油二酯含量要高出5%左右，并且時(shí)間減少了2h左右。

3.3 采用超臨界體系具有的優(yōu)勢在于粘度低、溶解性高。超臨界狀態(tài)下流體二氧化碳同時(shí)起到溶劑和催化劑的作用，由于CO2是非極性分子，可避免其它方法出現(xiàn)中毒和催化劑失活的現(xiàn)象。另外，重要的是在該反應(yīng)環(huán)境下可阻止甘油解逆反應(yīng)，從而提高了甘油二酯的含量。

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Study on enzymatic synthesis of diacylglycerol by glycerolysis in supercritical system

REN Yun-hong,SUN Bo,LIU Jing,JIANG Lian-zhou,YU Dian-yu*

（School of Food Science and Technology,Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China）

The preparation of DG by enzymatic glycerolysis in the CO2supercritical system was studied.The effect of substrate soybean oil/glycerin molar ratio，temperature，amount of enzyme，water content of glycerol，time and stirring speed on the preparation of DG were studied.Through the single factor and orthogonal tests，the optimum conditions were determined as follows:ubstrate molar ratio 2∶1， temperature 65℃ ， amount of enzyme 2.5%，water content of glycerol 1%，time 7h，stirring speed 120r/min.The product content of DG were 70.2%，of which 1，3-DG were 56.2%.Compared with the conventional glycerolysis，the content of DG were much more than 7%，of which 1，3-DG were much more than 5%，and time reduced about two hours.

soybean oil； glycerolysis； lipase Lipozyme RMIM； CO2supercritical； diacylglycerol

TS201.1

B

1002-0306（2011）10-0337-04

2010－10－26 * 通訊聯(lián)系人

任運(yùn)宏（1959-），男，高級(jí)實(shí)驗(yàn)師，研究方向：農(nóng)產(chǎn)品加工及貯藏工程。

國家863高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃（2010AA101503）。