綠色木霉菌液態發酵產黃色素動力學模型的建立

張曉毅，趙美美，于 新,﹡

（1.安徽農業大學茶與食品科技學院，安徽合肥 230036；2.仲愷農業工程學院輕工食品學院，廣東廣州 510225）

綠色木霉菌液態發酵產黃色素動力學模型的建立

張曉毅1，2，趙美美1，于 新1,﹡

（1.安徽農業大學茶與食品科技學院，安徽合肥 230036；2.仲愷農業工程學院輕工食品學院，廣東廣州 510225）

為構建綠色木霉菌液態發酵產黃色素動力學模型，在綠色木霉菌分批發酵過程中測定了菌體干重、總糖濃度、黃色素色價和pH變化，使用Origin軟件將經典發酵動力學方程擬合后得到綠色木霉菌菌體生長、黃色素合成和基質消耗的動力學模型及參數。結果表明，模型與實驗數據兩者能較好地擬合，可以較好地預測發酵過程。

綠色木霉菌，分批發酵，黃色素，動力學模型

食用色素是食品調色的重要原料之一，是食品添加劑的重要門類。近年來，利用微生物發酵色素逐漸成為生產天然色素的熱點，由于其成本較低，且無毒、安全、轉化率高，發展前景十分廣闊。木霉菌（Trichoderma spp.）屬于半知菌亞門，絲孢綱，絲孢目，絲孢科，粘孢菌類，是一類普遍存在的真菌。國內利用微生物產天然黃色素主要集中在對紅曲霉菌株資源的利用上[1]，鮮見有關于綠色木霉菌（Trichoderma viride）代謝產生黃色素的研究。Betina等[2]對T.viride所代謝的黃色素進行了結構鑒定，結果表明其包含的兩種黃色素為結構已知的蒽醌類物質。吳曉冰[3]等對綠色木霉菌T.viride發酵產生的黃色素進行了穩定性的初步研究，發現該黃色素具有較好的穩定性。黃色素作為三原色之一，是重要的色素品種，在食品及飼料工業、醫藥工業、化妝品行業乃至紡織工業方面占據著舉足輕重的地位。本文對綠色木霉菌產黃色素的液態分批發酵動力學進行了研究，對菌體生長動力學、黃色素合成動力學和基質消耗動力學進行曲線擬合并建立了動力學模型，以期定向控制黃色素的產生，為天然黃色素的發酵生產提供研究依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

綠色木霉菌（Trichoderma viride） 購于廣東微生物研究所；Na2HPO4、NaOH、瓊脂、乙醇、乙酸、三氯乙酸、乙酸鈉、鄰聯甲苯胺 均為分析純，天津大茂化工廠；葡萄糖氧化酶、過氧化物酶 上海羅氏公司；藥品、試劑除特別注明外 均為分析純。

UV-1700型紫外可見光譜分析儀日本島津公司；FA1004型分析天平 上海良平公司；LS-B35型立式壓力蒸汽滅菌鍋 江陰濱江醫療設備廠；SZ-93自動雙蒸水器 上海亞榮生化儀器廠；SW-CJ-IF型單人雙面無菌超凈工作臺 蘇州凈化設備有限公司；LRH-250A型生化培養箱 廣東省醫療器械廠；SHZ-3水環式真空泵 河南鞏義杜莆儀器廠；低溫冷藏箱 海爾；JJ500精密電子天平 美國G&G公司；800型電動離心機 江蘇金壇市金城國勝實驗儀器廠；實驗中所用玻璃器具均洗凈，用蒸餾水淋洗。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌種活化 斜面培養基：PDA培養基。將綠色木霉菌T.viride母種在PDA斜面培養基上進行斜面劃線法轉種活化，28℃培養5d。

孢子懸液制備：從斜面挑取孢子至無菌水中混合均勻，使孢子濃度達到105～106CFU/mL。

1.2.2 黃色素的發酵培養 稱取馬鈴薯→自來水加熱煮沸30min→過濾→調配各成分濃度→分裝到各錐形瓶→滅菌（121℃，20min）→接種→發酵培養（35℃，120r/min）

錐形瓶裝液量50mL/250mL，接種孢子懸液5mL，30℃、120r/min空氣恒溫搖床連續培養9d，間隔24h取樣測定各動力學參數。

1.2.3 測定方法 菌絲生物量的測定：將發酵原液用經恒重的濾紙抽濾，將濾紙和菌絲體在105℃烘至恒重，稱量即可求得菌體生物量[4]。pH的測定：pH計法。葡萄糖測定：葡萄糖氧化酶法。發酵液色價的測定：準確取一定體積發酵原液濾液，加蒸餾水稀釋40倍，用分光光度計在380nm處[2]測定吸光值，色素色價（U/mL）以吸光值與稀釋倍數的乘積來表示，計算方法如下：

式中，E-發酵液色價；U-色素的含量單位；A-樣品溶液的Abs值；R-發酵原液的稀釋倍數。

2 結果與分析

2.1 黃色素發酵過程代謝變化

圖1 綠色木霉菌液態發酵過程代謝變化曲線

對綠色木霉菌進行分發酵培養，每隔24h取樣分別測定發酵液中的葡萄糖濃度、菌體干重、色價和pH，結果見圖1及圖2。由圖1可見，綠色木霉菌生長延遲期較短，發酵24h后進入對數生長期，菌體及黃色素濃度迅速增加，發酵液葡萄糖濃度逐漸下降，隨著葡萄糖基質的消耗，菌體和黃色素濃度趨于穩定。發酵120h時，菌體量達到0.22675g，黃色素濃度為15.0U/mL。另外，黃色素的增長率在發酵50h之后與菌體生長增長率接近，色素生成曲線與菌體生長接近平行，因此可以確定綠色木霉菌黃色素的發酵過程是生長偶聯型。發酵3～7d，菌體處于生長穩定階段，培養基中菌絲球體積變大，菌體干重達到最大值（0.2268mg/mL），發酵液的pH變化不大，說明此階段代謝產物生成較少或合成了中性的次級代謝物質。

圖2 綠色木霉菌生長過程中pH及葡萄糖濃度的變化

式中：μm為菌體最大生長速率；Cx為菌體干重（g）；Cx,max為最大菌體干重（g），當t=0時，Cx=C0。

該方程的積分式為：

2.2 菌體生長動力學模型

細胞生長動力學最常用的方程有Logistic方程和Monod方程，其中Logistic模型是一個典型的S型曲線[4]，能很好地反映分批發酵過程中普遍存在的菌體干重增加對自身生長的抑制作用。由綠色木霉菌菌體生長曲線可知，當菌體生長過了對數期之后，菌體重量不再增加，原因是發酵液達到最大細胞質量濃度后阻礙了綠色木霉菌菌體的生長。因此，將Logistic方程應用于綠色木霉菌菌體生長的動力學模型[5]。

Logistic方程：

將實驗測得結果C0=0.0356（g），Cx,max=0.2268（g）代入方程，得：

利用Origin7.5軟件對紅曲霉生長的實驗數據進行非線性擬合（圖3）,可得μm=0.04816h-1。因此,菌體生長的動力學模型方程為：

圖3 菌體生長擬合曲線

對所測得的實驗數據進行非線性擬合，結果見圖3，從圖3可看出，黃色素菌體生長擬合曲線與實測值能較好地吻合，基本上反映了綠色木霉菌菌體的生長情況。

2.3 黃色素合成動力學模型

根據經典的描述微生物產物合成的動力學模型，采用Leudeking-Piret模型：

根據產物形成與菌體生長的關系，Gaden[6]將產物形成分成3類：a.產物形成與細胞生長相偶聯；b.產物形成與細胞生長部分偶聯；c.產物形成與細胞生長沒有關系。Luedeking和Piret為此總結下式來描述產物形成與細胞生長的關系：當α=0，β≠0時，產物形成與細胞生長無關；α≠0，β≠0時，產物形成與細胞生長部分偶聯；α≠0，β=0時，產物形成為生長偶聯型。根據2.1所得出的結論，黃色素的形成與細胞生長是偶聯關系，因此采用產物形成偶聯動力學模型[7]：

式中，p為用色價來表征的黃色素產量，U/mL；α為與細胞生長相關常數。

將式（2）代入方程，積分得：

式中，C0=0.0356（g），Cx，max=0.2268（g），μm=0.04816（h-1），代入方程，利用Origin7.5軟件軟件對黃色素產生動力方程進行非線性擬合，求得α=5.618，因此黃色素合成動力方程為：

圖4 黃色素合成擬合曲線

2.4 基質消耗動力學

在本發酵過程中，以葡萄糖為限制性基質，葡萄糖作為唯一碳源，主要用于發酵過程中菌體生長消耗、維持其代謝活動和生成黃色素消耗三部分，由于維持其代謝活動和生成黃色素消耗的底物量很少，可歸結為菌體生長消耗部分，故基質消耗可用與Luedeking-Piret相似的方程式表示[8-9]：

將C0=0.0356（g）和S0=0.02（g/mL）代入得：

利用Origin7.5軟件按得到的式（4）對發酵過程中葡萄糖實測值進行非線性擬合，可得b=0.4886,結果見圖5，得到基質消耗量（S）隨時間變化的函數：

從擬合圖形來看（圖5），所選的基質消耗模型基本可以準確地反映發酵過程中葡萄糖消耗的實際情況。

圖5 基質（葡萄糖）消耗擬合曲線

3 結論

在綠色木霉菌產黃色素的液態發酵過程中，通過測定菌體干重、葡萄糖濃度、色價和pH，經數據擬合后得到菌體生長、黃色素合成和基質消耗的動力學模型及參數。從綠色木霉菌產黃色素的液態發酵過程曲線可以得出綠色木霉菌體生長和黃色素的合成屬于生長偶聯型，因此從其發酵過程類型來看，黃色素的產生可能直接來源于初級代謝[10]。結合圖1綠色木霉菌黃色素合成曲線，黃色素量在發酵中后期反而有所下降，推測部分黃色素作為前提物質參與了次級代謝過程[11]。通過本實驗對綠色木霉菌液態發酵黃色素動力學的初步研究所得到的結果，我們將在進一步的實驗中進行補料分批發酵，逐漸加入營養物質，減少其對產物合成的阻遏作用[12]，避免高濃度營養物質對代謝產物的抑制作用，提高發酵產量。

本研究通過Logistic方程和Luedeking-Piret方程提出模型，應用Origin7.5軟件對實驗數據進行處理計算，得到了可用于菌體生長、黃色素合成和底物消耗的動力學曲線且能較好地擬合，得出的綠色木霉菌液態發酵產黃色素的過程的動力學模型，在實驗范圍內揭示了黃色素發酵代謝的基本特征，對實際生產有一定的參考依據。

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Kinetices model establishing for yellow pigment of Trichoderma viride by liquid state fermentation

ZHANG Xiao-yi1,2,ZHAO Mei-mei1,YU Xin1,*

（1.College of Tea and Food Science and Engineering,Anhui Agricultural Unversity,Hefei 230036,China；2.College of Light Industry and Food Science,Zhongkai University of Agriculture and Engineering,Guangzhou 510225,China）

In order to set up the kinetices model with the liquid state fermentation of yellow pigment by Trichoderma viride，during the producing of yellow pigment，the net weight of thallus，the density of total suger，valeur and pH degree were tested.Then classical fermentation kinetic equation of yellow pigment was simulated with the origin software.Results showed that they matched well，and the models can predict fermentation perfectly.

Trichoderma viride；batch fermentation；yellow pigment；kinetices model

TS202.3

A

1002-0306（2011）10-0089-04

2010-12-07 *通訊聯系人

張曉毅（1985-），男，碩士，研究方向：食品科學。

國家自然科學基金（30871765）。