凝膠色譜法測定法羅培南鈉顆粒高分子雜質的含量

楊 娜，鞏麗萍，王維劍，丁 勃

(山東省食品藥品檢驗所，山東濟南250101)

法羅培南(fampenem)是1997年投放市場的第1個青霉烯類抗生素，對各種β－內酰胺酶穩定，對厭氧革蘭陽性菌及多數革蘭陰性菌的抗菌活性均等同于或優于頭孢菌素及青霉素類抗生素［1］.目前，在各國藥典中，僅《日本藥典》中有收載，但未列高分子雜質檢查項目.因法羅培南是一種臨床上常用的β－內酰胺類抗生素.經多年研究證明，β－內酰胺類抗生素所致的速發型過敏反應并非藥物本身所致，是和此類藥物中存在的高分子雜質有關，故建立其法羅培南聚合物含量的測定方法，以更好地控制產品的質量.

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Agilent1100高效液相色譜儀:G1310A單元泵;G1314A檢測器;CAG Bootp Server程序.

1.2 藥品與試劑 法羅培南鈉對照品(批號:090401，含量:81.1%，山東新時代藥業有限公司);法羅培南鈉顆粒 (批號090601，090602，090603，山東新時代藥業有限公司，規格200 mg).葡聚糖凝膠G－10(進口)、藍色葡聚糖2000、磷酸氫二鈉(分析純)、磷酸二氫鈉(分析純).

2 方法與結果

2.1 色譜條件 色譜柱:自制葡聚糖凝膠G－10(不銹鋼內徑為1.3 cm，柱高度為40 cm)色譜柱;流動相A為pH7.0的0.1 mol·L 磷酸鹽緩沖液［0.1 mol·L 磷酸氫二鈉 －0.1 mol·L磷酸二氫鈉)(61∶39)］，流動相 B 為水;流速:1.0 mL·min－1;檢測波長:254 nm，進樣量 100 μL.取 0.1mg·ml－1藍色葡聚糖2000溶液100 μL注入液相色譜儀，分別以流動相A、B為流動相測定，記錄色譜圖.理論板數按藍色葡聚糖2000峰計算均應不低于700，拖尾因子均應小于2.0.在兩種流動相系統中藍色葡聚糖2000峰保留時間的比值應在0.93～1.07之間.稱取法羅培南鈉對照品12.36 mg，置200 mL量瓶中，用0.1 mg·mL－1的藍色葡聚糖2000溶液溶解并稀釋至刻度，搖勻.量取100 μL注入液相色譜儀，以流動相A進行測定，記錄色譜圖.高聚體的峰高與單體與高聚體之間的谷高比應大于2.0.另以流動相B為流動相，精密量取對照溶液100 μL，連續進樣5次，峰面積值的相對標準偏差應不大于 5.0%［2］.

2.2 檢測限與定量限的測定 取法羅培南鈉對照品，用水制成每1 mL含法羅培南鈉24.59 μg的溶液，以流動相A為流動相，精密量取100 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖，此時峰高約為基線噪音的3倍(S/N約為3)，據此計算本品檢測限為 2.46 μg，定量限為 8.2 μg.

2.3 專屬性試驗

2.3.1 葡聚糖2000溶液的制備 用水制成每1 mL含葡聚糖2000 0.1 mg的溶液.

2.3.2 對照品溶液的制備 精密稱取法羅培南鈉對照品13.54 mg，置200 mL量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻.

2.3.3 供試品溶液的制備 取法羅培南鈉顆粒(平均裝量為 1.872 2 g，規格為 0.2 g)2.405 6 g，置 50 mL 量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻.

2.3.4 分離度溶液的配制 取法羅培南鈉顆粒適量，用0.1 mg·L－1藍色葡聚糖2000溶液溶解稀釋制成每1 mL含法羅培南 512.55 μg，量取 100 μL 注入液相色譜儀，記錄色譜圖見圖1.藍色葡聚糖2000與供試品主峰達到有效分離.保留時間表示流動相流速確定條件下的Kav=0的洗脫時間，即相當于被排阻的聚合物洗脫的保留時間，法羅培南鈉聚合物的峰與藍色葡聚糖的峰重疊，保留時間一致.

2.4 對照品溶液的線性和范圍 精密稱取法羅培南鈉對照品10.06 mg，置10 mL量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，備用.分別取 100、88、75、62.5、50、25、12.5 和 6.25 μL 進樣，記錄色譜峰(圖2).

圖1 法羅培南鈉顆粒與葡聚糖2000色譜圖

圖2 法羅培南對照品色譜圖

圖3 法羅培南鈉顆粒色譜圖

表1 對照品溶液的線性試驗測定結果

結論:法羅培南鈉對照品溶液5.1 ～81.6 μg·mL－1濃度范圍內與其峰面積呈良好的線性關系.

2.5 供試品濃度與聚合物峰面積的線性和范圍 精密稱取法羅培南鈉顆粒2.580 4 g(相當于法羅培南0.275 7 g)，置50 mL量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，備用.分別取100、80、60、40、20 和 10 μL 進樣，記錄色譜峰(圖 3).

表2 供試品溶液濃度與聚合物峰面積的線性試驗測定結果

結論:供試品溶液在55.14 ～551.40 mg·mL－1范圍內與法羅培南鈉聚合物峰面積呈良好的線性關系.

2.6 F值的穩定性試驗 照2.4配制法羅培南鈉對照品溶液(50.931 μg·L－1)，在室溫下放置，分別于0，2，4，6，8，24 h取樣，按上述色譜條件進樣測定，其法羅培南鈉峰面積分別為:3 885.193、3 886.425、3 853.446、3 797.703、3 798.836、3 788.945，計算F值(法羅培南鈉對照品濃度/與主峰面積比值).

表3 F值的重復性試驗

2.7 法羅培南鈉聚合物含量測定 取供試品照2.3.3配制供試品溶液;取2.4配制法羅培南鈉對照品溶液(50.931 μg·L－1)，照2方法與結果的色譜條件進行測定，結果見表4.

表4 樣品法羅培南鈉聚合物的含量測定

3 討論

3.1 本方法是利用凝膠色譜分子篩機制，讓藥物分子自由進入凝膠顆粒內部，而高分子雜質被排阻不能進入凝膠顆粒內部，在色譜過程不被保留，最早被流動相洗脫至柱外，表現為在Kav=0處流出.

實驗表明，在特定條件下，β－內酰胺類抗生素可以締合形式表現分子量較大的締合物，締合物在Sephadex G10凝膠色譜系統中的色譜行為和高分子雜質一樣，都在Kav=0處，表現為單一的色譜峰.按色譜條件對相關保留時間進行比較，確定供試品色譜圖中Kav=0處的峰即為聚合物峰.

3.2 采用自身對照外標法以法羅培南鈉對照品為對照，測定其在特定條件下締合時的峰響應指標，在改變色譜條件，測得供試品中的高分子雜質峰響應指標.方法簡便、快速，且自身對照外標法無需專門制備標準品又可同外標法一樣精確對高分子雜質峰進行定量，結果直觀.

3.3 對一個廠家3批次的法羅培南鈉顆粒分別進行高分子雜質測定，用自身對外標法進行定量.三批法羅培南鈉顆粒含量在0.13% ～0.14%范圍.

［1］趙霞，胡昌勤，金少鴻.法羅培南鈉中有關物質測定方法的建立［J］.中國藥學雜志，2005，40(5):68 －70.

［2］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典2010版(二部)［S］.北京:中國醫藥科技出版社.2010.