苯巴比妥原料有關物質測定方法的比較

徐 飛

(南通精華制藥股份有限公司，江蘇南通226006)

苯巴比妥化學名為5－乙基－5－苯基－2，4，6(1H，3H，5H)－嘧啶三酮，是我公司生產的一種鎮靜催眠和抗驚厥原料藥，用于焦慮、失眠、癲癇及驚厥.本公司在2007年申報的歐洲CEP注冊時遞交了一個企業內部的HPLC方法對苯巴比妥的有關物質進行控制，這種方法使用的是梯度洗脫，檢測時間較長，當時主要考慮對苯巴比妥的起始原料苯基乙基丙二酸二乙酯及其中的一些雜質進行控制，今年4月份歐洲EP7.1頒布了苯巴比妥的新檢測方法，所以對兩者方法進行適當的分析對比.

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Waters600泵，486檢測器，717自動進樣器，Empower色譜軟件.

1.2 藥品和試劑 苯巴比妥二級標準品(本公司制備)，苯巴比妥產品(本公司生產)，甲苯比妥工作標準品(泰興森萱)，苯巴比妥雜質 A、B(從 EDQM購買)，甲醇為色譜純(Merk公司)，其余試劑為分析純.

2 方法與結果

2.1 色譜條件 CEP規格方法測試苯巴比妥的有關物質，方法為:色譜柱Cs/Cm L1(4.0 mm ×250 mm，5 μm，Waters公司)，流動相A:乙酸鈉三水化合物pH4.5，流動相B:甲醇流速 1.0 mL·min－1，檢測波長 220 nm，進樣量 10 μL，梯度洗脫方法見表1.

表1 CEP測定梯度洗脫方法

EP7.1的方法為:流動相為:緩沖溶液 －甲醇 =60∶40，緩沖溶液:將6.6 g乙酸鈉溶于900 mL超純水，加入3 mL冰醋酸，再用冰醋酸調節pH至4.5，然后用水稀釋至1 000 mL，流速 1.0 mL·min－1，檢測波長254 nm，進樣量20 μL.柱溫為室溫.均是采用外標法對雜質進行計算.

2.2 樣品制備

2.2.1 對照品溶液的制備 分別制備苯巴比妥自身對照液、雜質A和雜質B濃度為0.005 mg·mL－1的甲醇溶液.

2.2.2 樣品溶液的制備 精密稱取苯巴比妥樣品，用甲醇配制成5 mg·mL－1的樣品溶液.

2.3 系統適用性和專屬性比較 按EP7.1的方法在雜質A和B的混合溶液譜圖中計算出A和B之間的分離度為1.97，配制6個苯巴比妥工作標準品的溶液計算其重復性RSD為0.5%，有很好的重復性.分別采用雜質A和B及混合樣，圖譜顯示各峰獨立清晰且無任何溶劑的干擾.CEP規格方法對雜質A和B的分離度不能達到大于1.5的要求，且因其梯度洗脫，所以整個基線波動變化較大，對小雜質的檢測有影響.

2.4 檢測限和定量限的比較 在兩種方法條件下，以信噪比為3∶1時相應濃度確定為檢測限，信噪比為10∶1時確定為定量限，分別配制一定低濃度的甲苯比妥和苯巴比妥進行測試，結果EP7.1方法對甲苯比妥的檢測限是0.005 0%，定量限是0.017%(相對于測試樣)，苯巴比妥的檢測限是0.002 7%，定量限是0.092%(相對于測試樣).CEP方法對甲苯比妥的檢測限是0.006 1%，定量限是0.021%(相對于測試樣).從數據可知EP7.1的方法檢測限和定量限都比CEP方法更好，其檢測靈敏性更高.

2.5 兩種標準樣品測試比較 EP7.1方法主要控制雜質A(5－乙基 －2，6－二亞胺基 －5－苯基四氫嘧啶酮)(≤0.15%)和B(5－乙基－6－亞胺基－5－苯基二氫嘧啶二酮)(≤0.15%)，其余未指明雜質≤0.10%，總雜質≤0.20%;CEP注冊方法控制巴比妥酸≤0.15%，甲苯比妥≤0.15%，其余未指明雜質≤0.10%，總雜質≤0.25%.在兩種方法條件下，對本公司生產的10批進行檢測，EP7.1方法能檢測出雜質B，而CEP方法不能檢出，且對樣品中主要雜質甲苯比妥的檢測，EP7.1方法能檢測大于0.01%的效果，對巴比妥酸也能檢測，其余未指明雜質EP7.1方法能檢測出4個，CEP方法只能檢測出2～3個，雖然CEP方法是為了控制起始原料的雜質，但在成品檢測結果中未有起始原料的有關雜質，且一批樣品的分析時間CEP比EP7.1方法長20 min.可見，EP7.1方法能更加有效檢測控制苯巴比妥產品中的雜質，是一種更適用可行的檢測方法.相關圖譜見圖1～6.

3 討論

通過對苯巴比妥兩種HPLC分析方法比較可以看出，EP7.1方法更加靈敏，對雜質的檢查更加有效可行，且每批檢測時間也縮短，提高了分析工作效率，本公司現已采用EP7.1方法進行日常檢測，且在歐洲的注冊也進行了分析方法變更申請.

圖1 EP7.1方法檢測雜質對照A和B

圖2 EP7.1方法檢測本公司注冊標準對照

圖3 EP7.1方法檢測本公司樣品

圖4 CEP注冊方法檢測雜質對照A和B

圖5 CEP注冊方法的標準對照測試

圖6 CEP注冊方法測試本公司樣品