植物油脂多不飽和脂肪酸的分離與富集研究

呂 微,蔣劍春,徐俊明

（中國林業(yè)科學研究院林產(chǎn)化學工業(yè)研究所，生物質(zhì)化學利用國家工程實驗室，國家林業(yè)局林產(chǎn)化學工程重點開放性實驗室，江蘇省生物質(zhì)能源與材料重點實驗室，江蘇南京 210042）

植物油脂多不飽和脂肪酸的分離與富集研究

呂 微,蔣劍春*,徐俊明

（中國林業(yè)科學研究院林產(chǎn)化學工業(yè)研究所，生物質(zhì)化學利用國家工程實驗室，國家林業(yè)局林產(chǎn)化學工程重點開放性實驗室，江蘇省生物質(zhì)能源與材料重點實驗室，江蘇南京 210042）

利用低溫冷凍結(jié)晶和尿素包合法在同一工藝條件下考察了五種植物油脂中多不飽和脂肪酸的分離和富集效果。低溫冷凍結(jié)晶初步分離得到的脂肪酸Ⅰ中，僅含少量飽和脂肪酸，總不飽和脂肪酸含量達到95%以上，達到PUFAs的預濃縮目的。尿素包合法富集PUFAs實驗中，光皮油、棕櫚油脂中PUFAs的分離效果最好，亞油酸純度達到96.67%和97.18%；小桐子油和大豆油脂中亞油酸含量分別為81.74%和91.75%；桐油中PUFAs的富集效果不明顯，總PUFAs純度僅由原來的85.36%提高到91.62%。

小桐子油，光皮油，桐油，棕櫚油，大豆油，PUFAs，分離，尿素包合法

多不飽和脂肪酸（Polyunsaturated Fatty Acids，PUFAs）是人體必需的營養(yǎng)物質(zhì)，具有重要的生理功能[1]，能夠促進身體發(fā)育和智力增長[2-3]、調(diào)節(jié)血脂、降低血中膽固醇和甘油三酯、改善血液微循環(huán)、提高免疫力，以及抗癌、抗腫瘤、預防心血管疾病等[4]；對風濕性關(guān)節(jié)炎、胃炎等的恢復保健也有功效[5]；在延緩衰老、減肥、美容等方面也有重要的生理作用[6]。因此，其潛在的醫(yī)用藥用價值受到了廣泛的關(guān)注，引起了醫(yī)藥、化妝品甚至食品等行業(yè)的高度重視。資源豐富的生物柴油原料——小桐子油、光皮油、桐油脂中含有大量的PUFAs[7-9]，小桐子油、光皮油中脂肪酸成分與食用大豆油、菜籽油、棕櫚油相似，具有生物活性的油酸、亞油酸含量很高[10]，桐油中三價PUFAs的含量高達85%[11]。將其中的PUFAs進行分離并富集為高純度PUFAs，則可以作為特定的藥物進一步研究開發(fā)并應用，具有重要的研究及應用價值。本文通過對小桐子油、光皮油、桐油和棕櫚油四種工業(yè)級油脂和大豆油脂肪酸進行冷凍結(jié)晶和尿素包合法分離PUFAs，并對冷凍結(jié)晶和尿素包合法[12－13]分離過程中的脂肪酸進行GC－MS組成和含量分析，比較冷凍結(jié)晶和尿素包合法對五種植物油脂不飽和脂肪酸（Unsaturated Fatty Acids，UFAs）的分離效果，為提高工業(yè)油脂PUFAs分離效果及高附加值開發(fā)利用提供技術(shù)支持和產(chǎn)品支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

小桐子油、桐油、棕櫚油、光皮油 工業(yè)級用油，來自江蘇強林生物質(zhì)能源有限公司；大豆油 產(chǎn)自益江糧油工業(yè)有限公司；尿素、乙醇、甲醇、氯仿、硫代硫酸鈉、異丙醚、碘化鉀、冰醋酸、一氯化碘等試劑

均為國產(chǎn)分析純；四甲基氫氧化銨（25%水溶液）。

RE－52C旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器、DF－101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器 鞏義市予華儀器有限責任公司；SH 2－Ⅲ循環(huán)水真空泵 南京科爾儀器設(shè)備有限公司；KHG－9123A型電熱恒溫鼓風干燥箱 上海一恒科學儀器有限公司；夏普（SHARP）冰箱（型號SJ－187） 杭州瑪?shù)峡萍加邢薰荆籄gilent GC－MS聯(lián)用儀 色譜型號Agilent technologies 6890N Network GC system，質(zhì)譜型號Agilent 5973 Network Mass Selective Detector，進樣器型號7683 Series Injector，美國Agilent公司。

1.2 油脂游離脂肪酸的制備

將7.4g NaOH溶于25m L蒸餾水后與50m L乙醇一起轉(zhuǎn)入三口燒瓶，油脂從分液漏斗恒速滴加到三口燒瓶，機械攪拌均勻，70℃下滴加反應1.5h，保溫2h，冷卻到室溫后滴加鹽酸至pH 3～4，室溫下繼續(xù)保溫1h后，靜置分層，下層為粗甘油相，上層為粗脂肪酸，上層水洗（50m L蒸餾水）1次，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去溶劑乙醇得粗脂肪酸。

1.3 UFAS的分離、尿素包合法分離PUFAs

1.3.1 低溫冷凍結(jié)晶分離飽和脂肪酸（Saturated Fatty Acids，SFAs）和UFAs 取粗脂肪酸20g與甲醇60g（質(zhì)量比1∶3）混合密封于0.5℃下預冷,－20℃下冷凍2h；冷凍條件下過濾，得澄清濾液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)得脂肪酸Ⅰ；待濾餅溶解后旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)脫除甲醇,得脂肪酸I0。

1.3.2 尿素包合法分離PUFAs 將脂肪酸Ⅰ、尿素、甲醇按比例（質(zhì)量比1∶1∶4）放入圓底燒瓶，55℃下攪拌加熱至混合溶解；冷卻后密封于0.5℃下預冷，－20℃下冷凍2h；冷凍條件下過濾，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濾液后，加入30m L異丙醚溶解脂肪酸，過濾出剩余尿素，將濾液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)得脂肪酸Ⅱ；濾餅為包合固相物。

1.4 脂肪酸成分和含量分析

脂肪酸甲酯化方法及氣－質(zhì)聯(lián)用法參照文獻[14]。Agilent GC－MS聯(lián)用儀，氣相色譜條件：HP－5毛細管柱（30m×0.32mm×0.5μm）；進樣溫度250℃；檢測器溫度250℃；以氮氣為載氣；升溫程序為100℃，保持2m in后，以5℃/m in升到250℃，然后保持5m in；進樣量1μL。質(zhì)譜條件：70eV電子能量：燈絲發(fā)射電流200μA；離子源溫度200℃；接口溫度250℃。成分鑒定主要依據(jù)質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫NIST02進行自動比對完成，根據(jù)數(shù)據(jù)庫所提供的脂肪酸的相對豐度計算出各脂肪酸的相對含量。

1.5 脂肪酸得率及收率計算

式中：Y1—脂肪酸Ⅰ的得率，%；m0—粗脂肪酸質(zhì)量，g；m1—脂肪酸Ⅰ的質(zhì)量，g；Y2—脂肪酸Ⅱ得率，%；m2—脂肪酸Ⅱ的質(zhì)量，g。

2 結(jié)果與討論

2.1 植物油脂粗脂肪酸組成及含量

五種油脂肪酸經(jīng)甲酯化處理及GC－MS檢測后，鑒定出9～13種脂肪酸甲酯，并經(jīng)面積歸一化法確定它們的含量，每種油脂脂肪酸中前9種的出峰時間基本一致，所含成分基本相同。但大豆油、棕櫚油、光皮油和小桐子油四種油脂中脂肪酸成分可歸為硬脂酸、軟脂酸、亞油酸、油酸四種；桐油中脂肪酸主要成分與其他四種相差較大，油酸含量較低，成分可歸為軟脂酸、硬脂酸、油酸、亞油酸、亞麻酸（α－亞麻酸9,12,15－十八碳三烯酸及γ－亞麻酸6,9,12－十八碳三烯酸），見表1。由表1可見，五種油脂中總PUFAs含量次序為桐油＞大豆油＞棕櫚油＞光皮油＞小桐子油。通過對五種植物油脂脂肪酸組分和含量的GC－MS分析，為PUFAS分離和富集過程中各組分、組分含量變化和分離效果的提供參照和比較。

表1 不同植物油脂脂肪酸組成及含量

2.2 低溫冷凍結(jié)晶分離不同植物油脂中UFAs

經(jīng)低溫冷凍結(jié)晶后所獲得的五種植物油脂脂肪酸Ⅰ的組成和含量如圖1所示。硬脂酸（除桐油的剩下少量未被除去外）已經(jīng)被全部分離，只剩下少量的軟脂酸留在脂肪酸Ⅰ中。總UFAs（油酸、亞油酸、亞麻酸）含量達到95%以上，說明一次低溫冷凍結(jié)晶后，基本達到預濃縮UFAs、減輕尿素包合分離PUFAs負擔的目的。但從亞油酸、亞麻酸的含量看，提高較少，所以總PUFAs含量仍不高。結(jié)合表2的脂肪酸Ⅰ得率和UFAs含量看，五種油脂中脂肪酸Ⅰ得率都不高，為35%左右。原因是實驗中甲醇∶脂肪酸用量比（3∶1，g/g）偏小，所加入3份的甲醇量不足以溶解一份的脂肪酸，使得部分待溶解的UFAs未溶解，冷凍時以固體形式與晶體一同留在濾紙上。因此，在冷凍結(jié)晶分離UFAs時應增大甲醇∶脂肪酸用量比，提高脂肪酸Ⅰ得率，降低亞油酸和亞麻酸在脂肪酸Ⅰ中的損失。但是，如果甲醇用量過多，就未能形成飽和甲醇－脂肪酸溶液，雖然使UFAs得率增大，且總UFAs含量也會降低，后期尿素包合法分離PUFAs的負擔增大。

圖1 不同植物油脂脂肪酸Ⅰ的組成及含量

2.3 尿素包合法富集植物油脂PUFAs

尿素包合后所得脂肪酸Ⅱ中組成與含量如圖2所示，尿素包合后軟脂酸、桐油脂肪酸中的硬脂酸被全部除去，油酸也被大量分離，亞油酸和亞麻酸含量大幅上升，總純度均達到91.5%以上（除小桐子油脂PUFAs純度81.2%外）。對于光皮油和棕櫚油，亞油酸含量在97%左右，純度已經(jīng)很高，所用尿素的量已基本能將單UFAs包合。但從表2來看，其脂肪酸Ⅱ的得率相對較低，因此，可通過適當增加甲醇用量提高脂肪酸Ⅱ得率。大豆油和小桐子油脂中PUFAs分離效果一般，純度還有一定的提升空間，可通過增加尿素用量來提高亞油酸純度。由于桐油脂肪酸成分和含量與其它四種油脂脂肪酸相差較大，出現(xiàn)其總PUFAs含量與其它PUFAs的含量提高程度相差很大，整個分離過程中亞油酸和亞麻酸的純度僅提高了6.277%，原因是對于桐油PUFAs，甲醇用量未能將脂肪酸完全溶解，影響尿素的包合能力，未能溶解在甲醇中的PUFAs在低溫－20℃下以固相形式與尿素包合物一起留在濾紙上。可見，對桐油PUFAs的分離既要增加尿素用量來提高純度，又需加大甲醇用量來提高得率。

圖2 不同植物油脂脂肪酸Ⅱ的組成及含量

2.4 植物油脂PUFAs分離及富集過程分析

從表2的酸值來看，酸值均較高，說明各個階段所得的脂肪酸雜質(zhì)極少，純度都很高，且從粗脂肪酸開始，整個分離過程酸值基本不變。表2中碘值的變化與圖1～圖3中GC含量及含量的變化一致，即每種油脂脂肪酸的碘值的高低都與粗脂肪、脂肪酸Ⅰ和脂肪酸Ⅱ中總UFAs和PUFAs含量的高低對應。從圖3的粗脂肪酸、脂肪酸Ⅰ和脂肪酸Ⅱ的總UFAs和PUFAs純度看，這五種植物油脂PUFAs分離和富集過程中，除桐油外的四種組成相同的油脂PUFAs經(jīng)冷凍結(jié)晶和尿素包合法分離富集后純度的上升程度基本相同：小桐子油（39.58%）、大豆油（33.47%）、棕櫚油（40.37%）及光皮油（41.36%）。經(jīng)過尿素包合后總UFAs和PUFAs的純度提升情況也基本一致：小桐子油（29.14%）、大豆油（26.04%）、棕櫚油（28.84%）及光皮油（30.50%）。雖然桐油粗脂肪酸中亞油酸和亞麻酸含量很高，但在整個分離過程中總UFAs和PUFAs純度提高不明顯。

表2 五種植物油脂PUFAs分離和富集實驗結(jié)果

從表2的脂肪酸Ⅰ得率看，油脂中脂肪酸Ⅰ得率較低，都在35%左右，桐油的更低（24.41%）。原因是由于每種油脂脂肪酸成分（特別是桐油）及含量的差異造成甲醇對每種油脂脂肪酸溶解能力的不同，形成甲醇－脂肪酸溶液的飽和程度也不同。低溫冷凍結(jié)晶實驗中甲醇∶脂肪酸用量比（3∶1，g/g）都偏小，使得部分待溶解的UFAs未溶解，導致脂肪酸中未溶解的UFAs在－20℃下凝固，在過濾時與晶體一同留在濾紙上。因此，在冷凍結(jié)晶分離UFAs時應增大甲醇∶脂肪酸用量比（尤其是對桐油脂肪酸的分離），提高脂肪酸Ⅰ得率，使亞油酸和亞麻酸的損失盡可能低。但是，如果甲醇用量過多，就未能形成飽和甲醇－脂肪酸溶液，雖然脂肪酸Ⅰ得率增大，但總UFAs和PUFAs含量卻會相應降低，后期尿素包和法分離PUFAs的負擔增大。

尿素包合法富集PUFAs過程中，尿素用量影響著PUFAs含量和脂肪酸Ⅱ得率的高低；甲醇用量既影響著脂肪酸、尿素的溶解和包合情況，又影響著脂肪酸Ⅱ的得率。從表2和圖1～圖3得到：小桐子油和大豆油脂中脂肪酸Ⅱ得率相對較高，總PUFAs純度還有待提高，應增加尿素的用量；而光皮油、棕櫚油脂中PUFAs的純度已經(jīng)很高，再增加尿素用量雖然能使純度有小范圍的提高，但脂肪酸Ⅱ得率會更低，在確保高純度條件下可考慮增加甲醇用量來提高得率。對于本身PUFAs含量就很高的桐油，在該條件下尿素包和法富集效果不明顯，從實驗結(jié)果上看既需要增加尿素用量提高亞油酸和亞麻酸的含量，又要增加甲醇用量，溶解更多的尿素和脂肪酸，提高總PUFAs純度和脂肪酸Ⅱ。

圖3 不同植物油PUFAs分離過程中UFAs和PUFAs含量注：1，粗脂肪酸；2，脂肪酸I；3，脂肪酸II；a，小桐子油；b，大豆油；c，棕櫚油；d，光皮油；e，桐油。

3 結(jié)論

3.1 五種油脂中PUFAs含量次序為桐油＞大豆油＞棕櫚油＞光皮油＞小桐子油。大豆油、棕櫚油、光皮油和小桐子油四種油脂中脂肪酸成分相同，主要成分均為亞油酸和油酸；桐油中脂肪酸主要成分是亞油酸和亞麻酸。

3.2 低溫冷凍結(jié)晶分離SFAs和UFAs，脂肪酸Ⅰ中只含少量SFAs，達到了預濃縮PUFAs目的。可通過增加甲醇用量，提高脂肪酸Ⅰ得率并減少亞麻酸和亞油酸的損失。3.3 尿素包合法分離PUFAs中，光皮油、棕櫚油脂中PUFAs的富集效果最好，亞油酸純度達到96.67%和97.18%，可適當增大甲醇用量，以達到提高脂肪酸Ⅱ得率的目的；小桐子油和大豆油脂中亞油酸純度分別為81.74%和91.75%，有必要同時增加尿素和甲醇用量以提高脂肪酸Ⅱ得率和總PUFAs含量；桐油中PUFAs的富集效果不明顯，總PUFAs含量僅由原來的85.36%提高到91.62%，也要通過增加尿素和甲醇用量以提高脂肪酸Ⅱ得率以及亞油酸和亞麻酸的純度。

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Separation and enrichment of polyunsaturated fatty acids in different vegetable fat

LV Wei,JIANG Jian-chun*,XU Jun-ming

（Institute of Chemical Industry of Forest Products，CAF，Keyand Open Lab.on Forest Chemical Engineering，SFA，Key Lab.of Biomass Energy and Materizal，Nanjing210042，China）

The separating and purifying effect of polyunsaturated fatty acids(PUFAs)in different vegetable fat were studied using lower temperature crystallization and urea adduction fractionation under the same technological conditions.Saturated fatty acid and unsaturated fatty acids(UFAS)were isolated by lower temperature crystallization.A little bit of saturated fatty acid and over 95%UFAs was detected in fatty acid Ⅰ obtained from the experiment of lower temperature crystallization，indicating that PUFAs was preconcentrated.For the enrichment of PUFAs using urea adduction fractionation，the best separation effect were displayed when PUFAs derived from palm oil and cornus wilsoniana seed oil were isolated，purities of linoleic acid were 97.18%and 96.67%.The contents of linoleic acid in Jatropha curcas L.seed oil and soybean oil were 81.74%and 91.75%.Unconspicuous effect of PUFAs in tung oil separation was depicted with the purity of total PUFAs increase from 85.36%to 91.62%.

Jatropha curcas L.seed oil； cornus wilsoniana seed oil； tung oil； palm oil； soybean oil； polyunsaturated fatty acid；separation；urea adduction fractionation

TS221

B

1002-0306（2011）10-0281-04

2010－11－08 * 通訊聯(lián)系人

呂微（1984-），女，碩士，從事生物質(zhì)能源轉(zhuǎn)化利用研究。

國家“863”計劃（2010AA101602）；國家林業(yè)局公益性行業(yè)專項經(jīng)費（201104046）；國家自然基金（30700634）；江蘇省基金（BK2009545）。