魷魚絲菌相分析與腐敗菌的分離鑒定

江華珍，翁佩芳，* ，沈寧春

(1.寧波大學生命科學與生物工程學院，浙江寧波 315211;

2.寧波魚之美食品廠，浙江寧波 315211)

魷魚絲菌相分析與腐敗菌的分離鑒定

江華珍1，翁佩芳1，*，沈寧春2

(1.寧波大學生命科學與生物工程學院，浙江寧波 315211;

2.寧波魚之美食品廠，浙江寧波 315211)

為解決提高水分含量會引起魷魚絲貯藏時間縮短的問題，研究了剛烘烤拉絲完水分含量為34%魷魚絲在貯藏過程中細菌總數、酸價、過氧化物值及菌相的消長情況。結果表明，在25℃保藏條件下，28d的細菌總數已接近國標限制上限3.0×104cfu/g，而酸價及過氧化物值變化相對較小。同時對相同工藝處理的三批魷魚絲在25℃保藏30d后進行菌相分離，得到兩株優勢腐敗細菌b1和b2。經常規生理生化結合分子生物學鑒定，確定菌株b1和b2分別為肉葡萄球菌和葡萄球菌屬es13菌株。

魷魚絲，水分含量，腐敗菌，分離鑒定

魷魚是頭足類海洋動物中槍烏賊和柔魚的俗稱，據報道全世界大洋中的總資源量約為4.2×108～6.5×108t。魷魚因其味道鮮美、營養豐富而逐漸成為非常重要的蛋白質資源，倍受消費者青睞［1］。目前市場流通的基本都是經過各種方式加工的成品或半成品魷魚，熟制品有魷魚絲、烤魷魚頭和烤魷魚片等［2］。魷魚絲屬即食干制水產品，為保證其保藏性，生產者主要采用控制其水分含量或添加化學防腐劑來抑制微生物的生長繁殖及色變。實際生產中魷魚絲成品水分含量一般控制在25%以下，這帶來的問題是產品口感粗糙和質地過硬，對部分消費者來說不太適宜食用，同時產品得率較低;而添加化學防腐劑則引起消費者對安全問題的擔憂。目前對魷魚絲的保藏研究較多的集中在魷魚絲褐變和甲醛含量的控制上［3－5］，對魷魚絲中微生物控制方面的研究只見少量幾篇報道［6－8］。如采用電子束輻照對魷魚或其制品進行冷殺菌，能有效地提高產品的貯藏性同時保持其原有的營養及口味;但同時造成產品初始酸價、揮發性鹽基氮和過氧化物值等高于對照組［8］。而對魷魚產品的菌相分析及優勢腐敗菌的分離，國內外未見相關報道。本工作以剛烘烤拉絲完水分含量為30%～35%的魷魚絲為實驗原料，測定其在25℃恒溫保藏過程中細菌總數、酸價、過氧化物值及菌相的消長情況;同時對25℃保藏30d后的魷魚絲進行細菌菌相分析，采用常規生理生化結合16S rRNA鑒定，探求導致產品變質的優勢腐敗菌，為快速有效監控魷魚絲品質變化和靶向抑制產品腐敗提供一定理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

北太平洋魷魚絲 剛烘烤拉絲完，水分含量為30%～35%，以下均稱魷魚絲，選取三個批次，分別為批次1(生產時間為2009年10月，水分含量34%)、批次2(生產時間為2009年12月，水分含量30%)和批次3(生產時間為2010年3月，水分含量32%)，寧波某水產品加工廠提供;營養瓊脂培養基、營養肉湯培養基、LB培養基 杭州微生物實驗廠，分析純;TaqTM DNA聚合酶、dNTP MasterMix、10×PCR 緩沖液、DL2000 DNAMarker、引物 27 f:5'－AGAGTTTGATCCTGGCTCAG－3'和 1492r:5'－TACGGCTACCTTGTTACGACTT－3'大連寶生物工程有限公司;6×DNA上樣緩沖液

Takara;電泳級瓊脂糖 BioBasic Inc;三氯甲烷、乙醚、碘化鉀 杭州化學試劑有限公司，分析純;冰乙酸 杭州高晶精細化工有限公司，分析純;硫代硫酸鈉、氫氧化鉀 浙江中星化工有限公司，分析純;結晶紫、番紅 國藥集團化學試劑有限公司，分析純;對氨基二甲基苯胺鹽酸鹽 分析純;過氧化氫 上海桃浦化工廠。

立式高壓滅菌鍋 上海申安醫療器械廠;恒溫恒濕培養箱 寧波江南儀器廠;雙控電泳儀 北京君意東方電泳設備有限公司;Eppendorf Mastercycler gradient梯度PCR儀 德國Eppendorf公司;紫外凝膠成像系統 美國BIO－RAD Laboratories公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 貯藏實驗 將魷魚絲無菌分裝到透明PE袋中，50g/袋，熱封包裝后置于25℃恒溫箱中貯藏，定期取出測定。批次1魷魚絲，從貯藏0d開始，每7d測其細菌總數、菌相、酸價和過氧化物值，直至貯藏終點;對所選的三批次魷魚絲，在貯藏30d后分別進行菌相分析。

1.2.2 貯藏終點的確定 各種品質指標按照動物干制水產品指標GB10144－2005，酸價≤130mg/g、過氧化值≤0.6g/100g、細菌總數≤3.0×104cfu/g，這三項指標若有一項超過國標規定的上限，則此樣品對應的貯藏時間即被視為樣品的貯藏終點［9］。

1.2.3 菌落總數測定 參照國標GB 4789.2－2010［10］。

1.2.4 酸價(AV)的測定 參照文獻［11］，取相同質量樣品，采用氯仿－甲醇提取法測定油脂質量。

1.2.5 過氧化物值(POV)的測定 脂肪提取采用氯仿－甲醇提取法，取提取液10m L減壓蒸餾，稱重作為油脂質量。另取 10m L，參照 GB/T5009－2003［12］進行測定計算。

1.2.6 菌相分離與生理生化鑒定 菌懸液的制備同1.2.1。取三個適宜稀釋液0.1m L，涂布于營養瓊脂培養基表面。每個稀釋液涂布兩個平皿，37℃培養48h。挑選菌落數合適(30～300)的平板，對整個平板或一定區域內所有菌落(通常30～100個菌落)，依據菌落形態、顯微鏡鏡下形態、革蘭氏染色、運動性等特征進行細菌分組，每組挑取所有菌落或若干菌落(至少2～3個菌落)，分離純化37℃培養24h;參照《常見細菌系統鑒定手冊》［13］和海產魚類細菌鑒定圖［14］，綜合菌落形態學、細胞形態學和生理生化等特征進行鑒定。若同組出現相異鑒定結果，則對本組再次進行分組、分離、鑒定。

1.2.7 16S rRNA鑒定［15］待測菌株經DNA抽提后，利用細菌 16S rRNA通用引物:引物 27 f:5'－AGAGTTTGATCCTGGCTCAG－3'和1492 r:5'－TACGGCTACCTTGTTACGACTT－3'進行 PCR擴增。擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測、回收純化。純化后的PCR產物與PMD－18T載體連接，然后轉入大腸桿菌感受態細胞，培養于選擇性 LB培養基(含AMP)中。挑取菌落，在加了AMP的LB液體培養基中進行搖床培養。PCR檢測含有目的基因的菌液交由上海英駿生物技術有限公司對插入的16S rRNA序列進行測定。

2 結果與討論

2.1 魷魚絲在貯藏期間菌落總數、酸價和過氧化物值及菌相的變化

2.1.1 菌落總數、酸價和過氧化物值的變化 將批次1魷魚絲置于25℃恒溫箱中保藏，每7d測細菌總數、酸價和過氧化物值，結果如表1所示。

由表1可以看出，菌落總數、酸價和過氧化物值隨貯藏時間的延長，呈增長的趨勢。其中菌落總數增長較快，28d達2.9×104cfu/g，已接近保藏期終點，到35d細菌菌落總數為1.57×106cfu/g，已嚴重超標，表明水分含量較高(34%)時，魷魚絲保藏時間只有1個月左右。酸價和過氧化物值變化較細菌菌落總數變化緩慢，保藏35d后分別為78.95mg/g和0.230g/100g，均低于國標所規定的上限130mg/g和0.6g/100g，這可能是由于魷魚絲中脂肪含量相對其它動物性食品較低(胴體含脂率0.844%)［16］，貯藏過程中由脂肪氧化而引起的品質變化在短期內不是很明顯。任愛清［9］對魷魚干的研究表明，水分含量18.17%、30℃保存1個月魷魚片的POV基本不變;6個月其過氧化物值增長小于2倍。

批次1魷魚絲貯藏時間為28d時菌落總數近3.0×104cfu/g，魷魚絲酸價和過氧化物值這兩個指標仍在國標規定范圍內。由于魷魚絲保藏過程中菌落總數的增長速率遠遠大于酸價與過氧化物值的變化，所以在后期實驗中選用菌落總數作魷魚絲貯藏實驗終點的判定指標。

表1 貯藏過程中魷魚絲細菌總數、酸價和過氧化物值的變化

2.1.2 魷魚絲菌相變化的初步分析 在相同條件下，測定了批次1魷魚絲在貯藏過程中的菌相及其變化規律，結果如表2和圖1所示。魷魚絲菌相相對來說較為單一，這可能與魷魚絲經過蒸煮和烘烤等熱處理殺滅了大部分微生物有關;從表2可以看出，從貯藏開始0d到35d，依據菌落形態及革蘭氏染色鏡檢結果將其分成三組;從圖1可以看出，雖然第三組菌為魷魚絲中初始優勢菌(58%)，但隨著貯藏時間的延長，其在菌相中的比例逐漸減少，第14d其只占4.3%，第21d后就不再出現，說明魷魚絲產品不適宜第三組菌的生長，隨著貯藏時間的延長，其自然消亡，因而未對其進行進一步鑒定。

表2 批次1魷魚絲菌相基本形態分組描述

圖1 25℃貯藏魷魚絲菌相消長情況

2.2 魷魚絲菌相分析

對三批次魷魚絲，分別在25℃貯藏30d后進行菌相分析，共分離得到190株細菌。魷魚絲屬熱加工產品，成品中菌相較單一。分離出的菌株按菌落形態特征及細菌形態特征分為兩組，第一組為米黃色(66株)，第二組為乳白色(124株)。對這兩組菌進行簡單的革蘭氏染色鏡檢、接觸酶實驗、氧化酶實驗、O/F實驗、精氨酸雙水解酶實驗的結果如表3。

表3 三批次魷魚絲菌落和生理生化特征

由表3的實驗結果可以初步判定這兩組菌均為葡萄球菌屬，將第一組菌和第二組菌分別命名為b1和b2。葡萄球菌屬和革蘭氏陽性球菌多數為非致病菌，營養要求不高，28～38℃均能生長。楊憲時和陳舒等人［17］對高水分調味扇貝半干制品進行細菌學研究，得出此產品中芽孢桿菌占主要地位，比例為60%左右;其次是葡萄球菌，比例為30%左右。衛生檢測時，魷魚絲制品中也常檢測出葡萄球菌，雖然不是致病菌，但由于其是加工過程中污染的，所以一般觀點認為，葡萄球菌的高檢出率提示水產制品熱加工后的工序存在一定的微生物污染［18］。

2.3 優勢腐敗菌的16S rRNA鑒定結果

2.3.1 DNA提取結果 所提取的DNA經瓊脂糖凝膠電泳、溴化乙錠染色后在凝膠成像儀下觀察(圖2)，可以看出有明亮的條帶出現，表明b1和b2菌株基因組DNA提取成功。

圖2 菌株b1與b2基因組DNA電泳圖譜

2.3.2 目標片段的擴增結果 以菌株b1和b2的基因組DNA為模板，以通用引物27 f和1492 r擴增16S rRNA基因片段，進行瓊脂糖凝膠電泳，結果如圖3所示。圖中有一條明顯的亮帶，說明目的片段擴增成功。

圖3 菌株b1與b2 16S rRNA基因PCR反應產物電泳圖譜

3 結論

3.1 魷魚絲酸價、過氧化物值在貯藏期內變化不顯著;而菌落總數在28d達2.9×104cfu/g，接近國標上限3.0×104cfu/g，由此貯藏實驗以菌落總數作為終點指標為宜。菌相較為單一，開始時有三組菌，14d后逐漸減少為兩組，經初步鑒定均為G+球菌。

3.2 相同處理的三批次魷魚絲在25℃保藏30d后，共分離出190株細菌，經常規生理生化結合16S rRNA鑒定，最終確定為葡萄球菌屬的兩株菌:菌株b1與肉葡萄球菌相似度最高，菌株b2與葡萄球菌屬es13菌株最為相似。

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Isolation and identification of spoilage bacteria in squid thread

JIANG Hua－zhen1，WENG Pei－fang1，*，SHEN Ning－chun2
(1.College of Life Science and Biotechnology，Ningbo University，Ningbo 315211，China;2.Ningbo Yuzhimei Seafoods Plant，Ningbo 315211，China)

In order to solve the problem of short storage time of squid thread caused by high moisture content，the total bacteria population，acid value(AV)，peroxide value(POV)and changes of bacterial flora were investigated，using the materials of just baked squid thread with a moisture content of 34%.The results showed that the total bacteria population nearly reached 3.0 ×104c fu/g，which was equal to GB value，stored at 25℃ for 28 days，while the AV and POV was comparatively low.Meanwhile，the bacteria flora of three same samples stored for 30 days were determined，and two strains of spoilage bacteria b1and b2were obtained.They were identified as Staphylococcus carnosus and Staphylococcus sp.es13，respectively，based on their physiological properties and the analysis of 16S rRNA gene sequence.

squid thread;moisture content;spoilage bacteria;isolation and identification

TS254.1

A

1002－0306(2011)08－0195－04

2010－08－03 *通訊聯系人

江華珍(1985－)，女，碩士在讀，研究方向:食品安全與質量控制。

寧波市科技局自然科學基金(2009A610171)。