響應面法優化微波輔助提取鎖陽兒茶素的工藝研究

劉增根，黨 軍，江 磊，陳 晨，陶燕鐸，梅麗娟，邵 赟，*

(1.中國科學院西北高原生物研究所，青海西寧 810001; 2.中國科學院研究生院，北京 100049)

響應面法優化微波輔助提取鎖陽兒茶素的工藝研究

劉增根1，2，黨 軍1，2，江 磊1，2，陳 晨1，2，陶燕鐸1，梅麗娟1，邵 赟1，*

(1.中國科學院西北高原生物研究所，青海西寧 810001; 2.中國科學院研究生院，北京 100049)

采用微波輔助技術進行鎖陽兒茶素提取，利用響應面法對其工藝進行優化。通過單因素實驗確定因素與水平，以兒茶素含量為考察指標，應用Box－Behnken設計3因素3水平實驗，依據回歸分析確定最優提取工藝條件。結果表明，微波輔助提取鎖陽兒茶素的優化工藝條件為:提取時間13.3min，液料比13.6∶1(mL/g)，微波功率208.5W。采用該工藝條件，提取的兒茶素含量為3.82mg/g，與預測理論值的相對標準偏差為0.18%。

響應面分析，鎖陽，兒茶素，微波輔助提取

鎖陽(Cynomorium songaricum Rupr.)，又名不老藥、地毛球、銹鐵棒，為鎖陽科鎖陽屬(Cynomorium L.)寄生植物鎖陽的干燥肉質莖，常寄生于蒺藜科白刺屬(Nitraria L.)植物根部，多生長于干旱與鹽堿的沙地，主產于內蒙古、甘肅、青海、新疆等西北部地區，是中蒙藥中的常用藥。鎖陽味甘性溫，具有補腎益精、潤腸養筋之功效，中醫上用于治療陽痿、遺精、不孕、腰膝酸軟、腸燥便秘等［1］。現代藥理學研究表明，鎖陽具有提高機體免疫力、清除自由基、抑制人體免疫缺陷病毒［2－3］、抑制血小板聚集［4］等多種藥理活性。根據其主要的藥理作用，常艷旭等［5］認為鎖陽中以兒茶素為代表的黃酮類，熊果酸為代表的三萜類，多糖及鞣質可以被看作是指標性成分。微波輔助提取技術具有設備簡單、適用范圍廣、提取效率高、選擇性強、重現性好、節省時間、節能、污染小等優點而被廣泛應用于食品、化工、農業和中藥材提取等領域［6］。本文采用微波輔助對鎖陽兒茶素進行提取，并對影響鎖陽兒茶素含量的幾個重要因素進行了響應面分析(Response Surface Methodology，RSM)，并優化其工藝條件。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鎖陽藥材 于2010年7月采自青海省柴達木地區，經中國科學院西北高原生物研究所梅麗娟高級工程師鑒定為鎖陽(Cynomorium songaricum Rupr.);兒茶素對照品 批號為877－200001，中國藥品生物制品檢定所;甲醇 色譜純，山東禹王試劑公司;磷酸 優級純，天津興華化學試劑廠;其余試劑 均為分析純;超純水。

WP800SL23－2微波實驗儀(帶回流、磁力攪拌)，SK5200HP科導超聲波清洗器，UPT－I－5優普超純水機，RE－52旋轉蒸發儀，HH－6數顯恒溫水浴鍋，Agilent1200LC高效液相色譜儀，AG204電子分析天平，101A－2E電熱鼓風干燥箱。

1.2 實驗方法

1.2.1 色譜條件及系統適應性實驗 色譜柱: PLATISILTM－ODS(250×4.6mm，5μm);流動相:乙腈－0.3%磷酸溶液(10∶90);流速:1.0mL/min;柱溫: 30℃;檢測波長:210nm;理論塔板數按兒茶素峰計算應不低于3000。

1.2.2 樣品溶液的制備 準確稱取干燥鎖陽粉末5.0g(過40目篩)，包入濾紙包，置于索氏提取器中，加60mL石油醚于圓底燒瓶中，回流提取90min進行脫脂，至溶劑無色，取出濾紙包揮干溶劑。再將適量乙醇放入圓底燒瓶，對樣品進行微波輔助提取，趁熱過濾，減壓濃縮至干，即得鎖陽提取物。稱取適量提取物，用甲醇超聲溶解后定容至25mL，搖勻，0.45μm微孔濾膜過濾，即得樣品溶液。

1.2.3 兒茶素含量的測定

1.2.3.1 標準曲線的繪制 準確稱取兒茶素對照品2.0mg，用甲醇溶解后定容至10mL，即得0.2mg/mL對照品溶液。分別精密吸取對照品溶液1.0、2.0、4.0、5.0、6.0、8.0、10.0、12.0μL，按上述色譜條件依次進樣，以進樣量X(μg)為橫坐標，峰面積Y(mAU)為縱坐標繪制標準曲線，得回歸方程為:Y=8991.2X+ 156.27(r=0.9998)，兒茶素在0.2～2.4μg范圍內與峰面積成良好的線性關系。

1.2.3.2 含量的測定 精密吸取樣品溶液按繪制標準曲線的方法測定兒茶素峰面積，再根據兒茶素標準曲線即可計算樣品溶液中兒茶素的含量。對照品溶液與樣品溶液高效液相色譜圖見圖1。

圖1 樣品的高效液相色譜圖

1.2.4 鎖陽兒茶素最佳提取條件的確定 結合單因素實驗結果分析，選擇乙醇濃度、提取時間、液料比及微波功率四個因素，應用Box－Behnken設計3因素3水平的實驗，并利用響應面法［7］對鎖陽中兒茶素的微波提取條件進行優化。

2 結果與討論

2.1 單因素實驗

2.1.1 乙醇濃度對鎖陽兒茶素提取的影響 設定提取時間16min，液料比1∶12及微波功率200W，分別選擇乙醇濃度為50%、60%、70%、80%、90%進行單因素實驗，測定峰面積，計算兒茶素含量。如圖2所示，隨著乙醇濃度的提高，鎖陽提取物中兒茶素含量變化不大，乙醇濃度為70%時，兒茶素含量相對最高。因此微波輔助提取時，選定70%的乙醇作為優化的乙醇濃度的單因素條件。

圖2 乙醇濃度對兒茶素提取的影響

2.1.2 提取時間對鎖陽兒茶素提取的影響 設定乙醇濃度70%，液料比1∶12及微波功率200W，分別選擇提取時間為4、8、12、16、20、24min進行單因素實驗，測定峰面積，計算兒茶素含量。由圖3可看出，隨著時間的增加，鎖陽提取物中兒茶素含量先增加后減少，至12min時兒茶素含量最高，在時間超過16min后，兒茶素含量下降較快。由此可知，微波提取時間不宜過長。從縮短生產周期、節約能源等方面綜合考慮，選定提取時間作為12min。

圖3 提取時間對兒茶素提取的影響

2.1.3 液料比對鎖陽兒茶素提取的影響 設定乙醇濃度70%，提取時間12min及微波功率200W，分別選擇液料比為4∶1、8∶1、12∶1、16∶1、20∶1進行單因素實驗，測定峰面積，計算兒茶素含量。由圖4可知，隨著液料比的增大，鎖陽提取物中兒茶素含量逐漸增加，當液料比為12∶1～16∶1時，兒茶素含量增加量很少;當液料比繼續增加時，兒茶素含量降低，可能是可溶性物質溶出太多，造成雜質含量增加。綜合考慮提取液總量和提取效率兩方面因素，選定12∶1作為優化的液料比的單因素條件。

圖4 液料比對兒茶素提取的影響

2.1.4 微波功率對鎖陽兒茶素提取的影響 設定乙醇濃度70%，提取時間12min及液料比12∶1，分別選擇微波功率為100、150、200、250、300、350W進行單因素實驗，測定峰面積，計算兒茶素含量。由圖5可知，隨著微波功率的增加，物質的加熱程度也隨之增加，使兒茶素能夠較容易被提取出來，即含量增加;在微波功率達到200W之后，兒茶素含量逐漸降低，這可能是由于高微波功率的熱效應導致兒茶素聚合或其他物質的溶出所致。因此選取200W作為優化的微波功率的單因素條件。

圖5 微波功率對兒茶素提取的影響

2.2 響應面法對微波提取鎖陽兒茶素提取條件的優化

2.2.1 響應面分析因素與水平的選取 根據Box－Benhnken的中心組合實驗設計原理，綜合2.1單因素影響實驗結果，選取提取時間、液料比、微波功率對鎖陽兒茶素提取影響較顯著的3個因素，在單因素實驗的基礎上采用3因素3水平的響應面分析法(見表1)對鎖陽中兒茶素的微波提取條件進行優化。

表1 響應面因素與水平

2.2.2 響應面分析實驗設計方案 以提取時間A、液料比B、微波功率C為自變量，鎖陽兒茶素含量為響應值(Y)，進行響應面分析實驗。實驗方案及結果見表2。

表2 響應面分析方案及實驗結果

2.2.3 響應面回歸模型的建立與分析 采用統計軟件Design Expert 7.0對表2實驗結果進行多元回歸擬合，得到的二次回歸方程模型為:Y=3.77+0.069A +0.23B+0.10C+0.092AB－0.22AC+0.047BC－0.13A2－0.33B2－0.30C2。實驗方差分析及顯著性檢驗結果見表3。

由表3可知，模型具有高度的顯著性(P＜0.01)，進一步通過失擬項(P＞0.05)、校正確定系數(= 0.9316)及變異系數(C.V.=2.60%)說明該模型擬合度較好，實驗方法可靠并能夠很好地描述實驗結果。從表3中還可看出，影響鎖陽兒茶素提取的各因素按影響大小排序依次是B＞C＞A，其中液料比和微波功率的影響達到顯著水平。

2.2.4 響應面圖分析 微波輔助提取鎖陽兒茶素的響應面圖如圖6～圖8所示。圖6為A(提取時間)和B(液料比)對兒茶素提取的響應面圖。保持B為一定值時，兒茶素含量隨著A的增加而升高，達到峰值后又快速降低;保持A為一定值時，隨著B的增加，兒茶素含量也出現先升高后降低的趨勢。等高線形狀近乎呈圓形，表明提取時間和液料比兩個因素間的交互作用較弱，這與表3的方差分析結果相吻合。

圖6 Y=f(A，B)的響應面圖

圖7為A(提取時間)和C(微波功率)對兒茶素提取的響應面圖。保持C為一定值時，兒茶素含量隨著A的增加而升高，達到峰值后趨于降低;保持A為一定值時，隨著B的增加，兒茶素含量也出現先升高后降低的趨勢。等高線圖呈扁圓形，表明提取時間和微波功率兩個因素間具有較強的交互作用，這與表3的方差分析結果一致。

圖7 Y=f(A，C)的響應面圖

圖8為B(液料比)和C(微波功率)對兒茶素提取的響應面圖。隨著B和C的增加，兒茶素含量先增加到最高，隨后又下降，表明B和C對兒茶素提取的影響也是比較大的;而等高線圖反映出兩個因素間的交互作用極弱，與表3的方差分析結果一致。

圖8 Y=f(B，C)的響應面圖

為了得到最優提取工藝條件，對二次回歸模型方程微分求解，得最優提取工藝參數為:液料比13.61∶1 (mL/g)，微波功率208.50W，提取時間13.33min。預測可獲得的最高兒茶素含量為3.83mg/g。

2.2.5 驗證性實驗 為了檢測實驗結果是否與真實情況相一致，根據以上實驗結果進行了驗證性實驗，考慮到實際操作的便利，將最佳工藝條件修正為:液料比13.6∶1(mL/g)，微波功率208.5W，提取時間

13.3min，在此條件下用70%乙醇進行5次平行實驗，兒茶素平均含量3.82mg/g，RSD為1.07%，與預測的最大響應值的相對標準偏差為0.18%。因此，實驗值與理論預測值相符，而且重復性也很好，說明優化結果可靠。

2.3 提取方法的比較

比較分析了3種提取法:乙醇加熱回流提取法、乙醇微波輔助提取法(帶磁力攪拌)和乙醇超聲提取法，結果見表4。結果表明，微波法提取率均大于加熱回流法和超聲提取法，而且與其他提取方法相比，微波提取法熱效率高、升溫快速而均勻，能顯著縮短提取時間、提高效率，而且所得有效成分(兒茶素)含量高，操作簡便快捷，溶劑消耗及廢物產生量低，故而可被廣泛用于天然植物活性物質的提取中［8］。

表4 不同提取方法的比較

3 結論

采用微波輔助提取法從鎖陽中提取分離出了兒茶素，并通過響應面分析得到了提取的優化條件:液料比13.6∶1(mL/g)，微波功率208.5W，提取時間13.3min，兒茶素含量3.82mg/g。本實驗還討論比較了微波提取與回流提取、超聲提取的效果差異，結果表明，微波提取鎖陽兒茶素耗時短、效率高、操作簡便。該研究結果為鎖陽在藥物領域的深入研究與開發提供了一定的理論基礎和參考。

［1］林佳.鎖陽的研究進展［J］.國外醫學中醫·中藥分冊，2003，25(6):332.

［2］Yakuqaku Zasshi.Inhibitory effects of some traditional medicines on proliferation of HIV－1 and its protease［J］. Nakamura N，2004，124(8):519.

［3］Ma C，Nakamura N，Miyashiro H，et al.Inhibitory effects of constituents from cynomorium songaricum and related triterpene derivatives on HIV－1 protease［J］.Chem Pharm Bull，1999，47 (2):141.

［4］Zhang C Z，Wang S X，Zhang Y，et al.In vitro estrogenic activities of Chinese medicinal plants traditionally used for the management of menopausal symptoms［J］.J Ethnopharmacol，2005，98(3):295.

［5］Chang Y X，Su G E.Discuss on effective and targeted component of Cynomorium songarium Rupr［J］.Res Pract Chin Med，2005，19(3):55－60.

［6］潘學軍，劉會洲，徐永源.微波輔助提取研究進展［J］.化學通報，1999(5):7－14.

［7］王燕，羅文謙，張志琪.響應表面優化法及其在天然產物成分提取中的應用［J］.安康學院學報，2009，21(1):77－81.

［8］聶金媛，張夢軍，吳世容，等.微波輔助提取方法和技術在中藥與天然產物研究與開發中的應用［J］.長沙大學學報，2003，17(4):40－43.

Optimization of microwave－assisted extraction of catechin from Cynomorium songaricum by response surface methodology

LIU Zeng－gen1，2，DANG Jun1，2，JIANG Lei1，2，CHEN Chen1，2，TAO Yan－duo1，MEI Li－juan1，SHAO Yun1，*
(1.Northwest Institute of Plateau Biology，Chinese Academy of Sciences，Xining 810001，China; 2.Graduate School of Chinese Academy of Sciences，Beijing 100049，China)

Microwave－assisted extraction was applied for catechin extraction from Cynomorium songaricum.Based on the single factor experiment，the response surface method with three factors at three levels was adopted according to the Box－Behnken design.Content of catechin was used as response value，the factors of optimum conditions for the extraction were determined by regression analysis of response surface methodology.The results showed that the optimal catechin extraction process conditions were obtained by microwave－assisted extraction as follows:extraction time was 13.3min，liquid－solid ratio was 13.6∶1(mL/g)，and microwave power was 208.5W. Under the optimum conditions，the extraction content of catechin was 3.82mg/g，with relative standard deviation 0.18%compared with theoretical value.

response surface methodology;Cynomorium songaricum;catechin;microwave－assisted extraction

TS201.2

B

1002－0306(2011)12－0325－04

2010－12－08 *通訊聯系人

劉增根(1987－)，男，在讀碩士研究生，主要從事天然藥物化學研究工作。

科技部國家科技支撐計劃(2007BAI45B00)。