雙酶法制備米糠蛋白抗氧化肽

梅德軍，于國(guó)萍，孫安敏

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150030)

雙酶法制備米糠蛋白抗氧化肽

梅德軍，于國(guó)萍*，孫安敏

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150030)

以提取的米糠蛋白為原料，研究其酶解工藝及其水解物的抗氧化活性。選取木瓜蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶雙酶水解制備米糠蛋白抗氧化肽。結(jié)果表明，木瓜蛋白酶與風(fēng)味蛋白酶酶活力之比為1∶1時(shí)，清除自由基的效果較佳。選取五個(gè)不同的影響因素，進(jìn)行了酶解工藝的單因素及正交實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果得出較佳酶解參數(shù)為:底物濃度(［S］)1.5%，加酶量4500U/g，pH6.5，溫度45℃，時(shí)間3h，在此條件下米糠蛋白水解物對(duì)DPPH自由基清除率為58.82%，對(duì)羥自由基的清除率為34.78%。

米糠蛋白，雙酶水解，抗氧化活性

稻谷是我國(guó)第一大糧食品種，其產(chǎn)區(qū)遍及全國(guó)各地。據(jù)國(guó)家統(tǒng)計(jì)局最新統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，1996年至2009年間，我國(guó)稻谷產(chǎn)量都維持在1.85億t左右，占全國(guó)糧食總產(chǎn)量的42%，位居世界第三位［1－3］。因此稻谷副產(chǎn)品的開發(fā)利用，對(duì)于我國(guó)國(guó)民經(jīng)濟(jì)的發(fā)展與提高國(guó)民生活品質(zhì)具有重大意義。米糠(Rice bran)是稻谷經(jīng)脫殼(Hull)后得到的糙米(Brown rice)在碾白過(guò)程中被碾下的皮層，是果皮、種皮、珠心層、糊粉層及米胚芽和小碎米屑的混合物，質(zhì)量約占稻谷的5%～6%［1］。米糠的組成成分含量并不完全相同，一般來(lái)說(shuō)，米糠中平均含蛋白質(zhì)15%，脂肪16%～22%，糖3%～8%，水分10%［3－5］，米糠蛋白是公認(rèn)的優(yōu)質(zhì)植物蛋白，其必需氨基酸的組成平衡合理，接近FAO/WHO推薦模式，其中賴氨酸含量較高，為其他植物蛋白所無(wú)法比擬［6］。米糠蛋白經(jīng)蛋白酶水解后轉(zhuǎn)變?yōu)殡念愇镔|(zhì)［7］。近年來(lái)，隨著對(duì)生物活性肽研究的不斷深入，人們發(fā)現(xiàn)抗氧化肽具有許多優(yōu)點(diǎn)，例如:高效、低成本以及低毒性，很適宜作為天然抗氧化劑使用［8］。抗氧化肽的制備主要是通過(guò)發(fā)酵法、酶法等生物技術(shù)手段從天然動(dòng)植物蛋白質(zhì)中得到［9］。酶法水解米糠蛋白的條件比較溫和，在水解過(guò)程中如果應(yīng)用兩種或多種蛋白酶，由于其具有不同水解位點(diǎn)，水解效率會(huì)更高，所得蛋白水解物物化性能優(yōu)于單一酶的效果［10－11］。本文以從米糠中提取的米糠蛋白為原料，利用雙酶水解對(duì)其抗氧化活性進(jìn)行研究，以期為米糠功能食品的開發(fā)提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

米糠蛋白(蛋白含量70.32%、水分含量5.60%)

實(shí)驗(yàn)室自制［12］;木瓜蛋白酶、中性蛋白酶 北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司;復(fù)合蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶 丹麥諾維信公司;胰蛋白酶、DPPH Sigma公司;其它試劑 均為分析純。

HH－4數(shù)顯恒溫水浴鍋 國(guó)華電器有限公司;低速離心機(jī)LD4－2A型 北京醫(yī)用離心機(jī)廠;DHG－9070A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司;AL－104型精密電子天平 上海梅特勒－托利多儀器設(shè)備有限公司;FDU－1100型冷凍干燥機(jī)

TOKYO RIKAKIKAI COMPANY;KQ－500B型超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司;UVmini－1240紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 日本島津;pHS－3C型精密pH計(jì) 上海雷磁儀器廠;HYP－1014消化爐 上海纖檢儀器有限公司;LNK－871凱氏定氮儀 江蘇省宜興市科教儀器研究所。

表2 不同蛋白酶的酶活力及其IC50值

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 蛋白質(zhì)含量的測(cè)定 凱氏定氮法(GB/ T5009.3－2003)。

1.2.2 蛋白酶活力測(cè)定 福林－酚法(GB/T23527－2009)。

1.2.3 米糠蛋白的酶解 工藝流程:粗米糠蛋白→2%的水懸浮液→熱變性處理(100℃，10min)→冷卻至室溫→調(diào)適宜的pH、溫度→酶解→滅酶(100℃，水浴5min)→離心(4000r/min，15min)→取上清液→分析測(cè)定抗氧化活性

1.2.3.1 酶的篩選 按照方法1.2.2測(cè)定五種蛋白酶的酶活，分別用復(fù)合蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶和中性蛋白酶進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，調(diào)其最適pH、溫度，酶的用量為5000U/g，酶解3h以后，100℃水浴中滅酶5min，冷卻離心，測(cè)定上清液的抗氧化活性，并計(jì)算得到這5種酶的IC50值。進(jìn)而確定適宜組合的酶的種類，并在總酶用量一定的前提下確定二者的比例關(guān)系。

1.2.3.2幾種因素對(duì)自由基清除率的影響 選定最佳酶配比后，在酶解過(guò)程中比較反應(yīng)溫度(20、30、40、50、60℃)、pH(5.5、6.0、6.5、7.0、7.5)、加酶量(2000、3000、4000、5000、6000U/g)、底物濃度(0.2%、0.5%、1%、2%、4%)和反應(yīng)時(shí)間(1.5、2.0、2.5、3.0、3.5h)對(duì)抗氧化肽制備的影響，確定適宜的酶解條件范圍，實(shí)驗(yàn)中利用酶解產(chǎn)物對(duì)DPPH自由基和羥自由基的清除率作為影響指標(biāo)。

1.2.3.3 正交實(shí)驗(yàn) 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取酶解溫度、pH、加酶量、底物濃度為4個(gè)考察因素，對(duì)每個(gè)因素取3個(gè)水平，進(jìn)行L9(34)正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，優(yōu)化雙酶水解的條件，因素水平如表1所示。

表1 正交實(shí)驗(yàn)因素及水平

1.2.4 米糠蛋白水解物的抗氧化性能檢測(cè)方法

1.2.4.1 清除DPPH自由基的測(cè)定方法［13］不同條件下酶解得到的米糠蛋白水解物，各取1mL置于試管中，再加入1mL 25μg/mL的DPPH溶液，混合均勻，反應(yīng)30min，在517nm處測(cè)其吸光值為Ai;另各取1mL上述米糠蛋白水解物置于試管中，分別加入無(wú)水乙醇1mL，反應(yīng)30min，在517nm處測(cè)其吸光值記為Aj;以1mL 25μg/mL DPPH和1mL無(wú)水乙醇反應(yīng)液做為空白對(duì)照，其吸光值記為A0。按照下式計(jì)算米糠蛋白水解物對(duì)DPPH自由基的清除率:

2 結(jié)果與討論

米糠蛋白水解物IC50值的計(jì)算方法［14］:將不同條件下酶解得到的米糠蛋白水解物，稀釋成5個(gè)的梯度濃度，按照上述方法分別測(cè)定其DPPH自由基的清除率，得出水解物濃度與其清除率關(guān)系圖，根據(jù)圖確定50%清除率所對(duì)應(yīng)的這一水解物樣品的濃度即為IC50值，IC50值越低，表明該水解物的抗氧化活性越強(qiáng)。

1.2.4.2 清除羥自由基的測(cè)定方法［15］將在不同條件下酶解得到的米糠蛋白水解物用蒸餾水稀釋10倍，各取0.5mL稀釋后的米糠蛋白水解物溶液，依次加入0.5mL 1.8mmol/L的FeSO4、0.5mL 1.8mmol/L的H2O2，混勻后靜置10min，再加入0.5mL 1.8mmol/L水楊酸，混勻，靜置30min，在510nm處測(cè)其吸光值記為Ai，當(dāng)用蒸餾水代替水楊酸時(shí)測(cè)得的吸光值記為Aj。空白對(duì)照組以蒸餾水代替大米蛋白水解物測(cè)得的吸光值記為A0。按照下式計(jì)算大米蛋白水解物對(duì)羥自由基·OH的清除率:

2.1 酶的篩選

2.1.1 五種蛋白酶的酶活測(cè)定及其水解米糠蛋白的IC50值 由表2可見(jiàn)，木瓜蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶以及胰蛋白酶的IC50值較低，也就說(shuō)明這3種蛋白酶酶解液清除自由基的能力最強(qiáng)，其中，木瓜蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶的最適宜溫度和pH比較接近，所以選擇這兩種酶進(jìn)行組合，對(duì)米糠蛋白進(jìn)行酶解。

2.1.2 木瓜蛋白酶與風(fēng)味蛋白酶酶活力比對(duì)抗氧化性的影響 調(diào)節(jié)pH至6.5，按木瓜蛋白酶與風(fēng)味蛋白酶酶活力比為2∶1、1∶1、1∶2分別加入5000U/g的混合酶，并計(jì)算這3種組合酶的IC50值，且與單一木瓜蛋白酶及風(fēng)味蛋白酶的IC50值進(jìn)行比較，結(jié)果如圖1所示。

圖1不同酶活力比對(duì)其IC50值的影響

由圖1可見(jiàn)，木瓜蛋白酶與風(fēng)味蛋白酶酶活力比為1∶1的情況下，IC50值最小，同時(shí)，從圖1中也可以直觀地看出，酶活力比為1∶1時(shí)的IC50值比單一木瓜蛋白酶及風(fēng)味蛋白酶的IC50值都要低，也就說(shuō)明其清除自由基的能力最強(qiáng)，所以后續(xù)實(shí)驗(yàn)均取1∶1作酶活力比。

2.2 幾種因素對(duì)自由基清除率的影響

2.2.1 溫度對(duì)清除自由基的影響 調(diào)節(jié)pH為6.5，加入5000U/g的雙酶，測(cè)定不同溫度水解3h的抗氧化性能，確定最佳的水解溫度，結(jié)果如圖2所示。

圖2 溫度對(duì)清除自由基的影響

從圖2可以看出，隨著溫度升高，酶活力增強(qiáng)，酶解液的抗氧化能力不斷增強(qiáng)，50℃時(shí)清除自由基的能力達(dá)到最大;當(dāng)溫度繼續(xù)升高時(shí)，過(guò)高的溫度引起了酶熱變性，反應(yīng)能力下降，進(jìn)而導(dǎo)致制得酶解液的抗氧化能力下降。因此，反應(yīng)溫度選50℃為最佳。

2.2.2 pH對(duì)清除自由基的影響 分別調(diào)節(jié)不同pH，加入5000U/g的雙酶，50℃水解3h，確定最佳的pH，結(jié)果如圖3所示。

圖3 pH對(duì)清除自由基的影響

pH會(huì)直接影響酶與底物的結(jié)合以及酶對(duì)底物的催化效果。從圖3可以看出，pH對(duì)反應(yīng)的影響比較明顯，pH為6.5時(shí)，清除兩種自由基的能力均最大，因此，pH定為6.5。

2.2.3 底物濃度對(duì)清除自由基的影響 精確配制濃度為:0.2%、0.5%、1%、2%、4%的米糠蛋白溶液，調(diào)節(jié)pH6.5，加入5000U/g的雙酶，50℃水解3h，以確定最佳的底物濃度，結(jié)果如圖5所示。

圖4 底物濃度對(duì)清除自由基的影響

由圖4可以看出，當(dāng)?shù)孜餄舛容^低時(shí)，酶與底物結(jié)合幾率較少。隨著底物濃度增加，酶分子與米糠蛋白的接觸機(jī)會(huì)增多，反應(yīng)程度較好，其抗氧化能力也明顯增強(qiáng)，但對(duì)兩種自由基清除能力的峰值并不完全一致。當(dāng)?shù)孜餄舛葹?%時(shí)，溶液清除羥自由基的能力達(dá)到最大，而對(duì)于DPPH自由基來(lái)說(shuō)，底物濃度為2%時(shí)則最大;隨著底物濃度繼續(xù)升高，在不斷受熱的情況下，米糠蛋白分子易產(chǎn)生交鏈聚合現(xiàn)象，因此制得的酶解液抗氧化能力反而下降。綜合考慮兩個(gè)指標(biāo)，底物濃度選為1%。

2.2.4 加酶量對(duì)清除自由基的影響 加酶量分別為:2000、3000、4000、5000、6000U/g，其它條件同上，確定最佳的加酶量，結(jié)果如圖5所示。

圖5 加酶量對(duì)清除自由基的影響

從圖5可以看出，在米糠蛋白酶解過(guò)程中，隨著加酶量的增加，酶解液的抗氧化能力不斷升高。在加酶量為4000U/g，清除羥自由基的能力達(dá)到最大，而清除DPPH自由基能力達(dá)到最高水平時(shí)是5000U/ g，再增加加酶量由于其水解度的進(jìn)一步提高，清除率反而會(huì)有所下降，因此，綜合考慮兩個(gè)指標(biāo)，選定4000U/g為最佳加酶量。

2.2.5 時(shí)間對(duì)清除自由基的影響 調(diào)節(jié)pH6.5，加入4000U/g的雙酶，50℃下水解時(shí)間分別為:1.5、2.0、2.5、3.0、3.5h，確定最佳的酶解時(shí)間，結(jié)果如圖 6所示。

圖6 時(shí)間對(duì)清除自由基的影響

由圖6可以看出，在1.5～2.5h內(nèi)，隨著時(shí)間的增加，清除兩種自由基的能力都緩慢增加，2.5h時(shí)清除羥自由基的能力達(dá)到最大，而對(duì)DPPH自由基而言，3.0h時(shí)達(dá)到最高。時(shí)間繼續(xù)增加，清除率反而略有下降，但是總體表現(xiàn)的并不是很明顯。因此，綜合考慮兩個(gè)指標(biāo)，反應(yīng)時(shí)間定為3.0h。

2.3 正交實(shí)驗(yàn)

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)，酶解時(shí)間對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響不明顯，故將酶解時(shí)間定為3h，正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

正交實(shí)驗(yàn)極差分析結(jié)果表明，影響米糠蛋白抗氧化肽對(duì)DPPH·和·OH兩種自由基清除能力的各因素的排列順序均為:D＞C＞B＞A，清除自由基的最佳酶解條件是A1B2C3D3，即:溫度45℃，pH6.5，加酶量為4500U/g，底物濃度1.5%。對(duì)表3的數(shù)據(jù)作進(jìn)一步分析可以看出:米糠抗氧化肽清除DPPH·能力(y)與清除·OH能力(x)之間存在顯著的相關(guān)性關(guān)系:y=0.0032x2+0.3981x+40.066(r=0.9699，p＜0.01)，說(shuō)明實(shí)驗(yàn)條件對(duì)二者的影響是一致的。

對(duì)最優(yōu)組合進(jìn)行3組驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果重現(xiàn)性較好，米糠蛋白水解物對(duì)DPPH·和·OH的清除率分別為58.82%和34.78%。

3 結(jié)論

3.1 確定了5種蛋白酶水解液清除DPPH自由基的IC50值，利用木瓜蛋白酶與風(fēng)味蛋白酶協(xié)同水解米糠蛋白制取抗氧化肽，在二者酶活力之比為1∶1時(shí)，酶解物清除自由基的效果較佳。

3.2 木瓜蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶雙酶水解米糠蛋白的最佳條件為:溫度45℃，pH為6.5，加酶量為4500U/g，底物濃度1.5%，時(shí)間3h。此時(shí)，米糠蛋白水解物對(duì)DPPH·和·OH的清除率分別為58.82%和34.78%。

3.3 雙酶水解獲得的米糠抗氧化肽清除DPPH·能力(y)與清除·OH能力(x)之間存在顯著的相關(guān)性關(guān)系。

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Preparation of rice bran antioxidant peptide with bienzyme hydrolysis

MEI De－jun，YU Guo－ping*，SUN An－min
(College of Food Science，Northeast Agricultural University，Harbin 150030，China)

The enzymatic hydrolysis technology of extracted rice bran protein and the antioxidation activity of the hydrolysate were studied，and rice bran peptides by hydrolyzing rice bran protein with compound enzyme of papain and flavorase was prepared.The optimum conditions were enzyme activity ratio of papain to flavorase 1∶1 for DPPH free radical scavenging.Five factors were selected to optimize the hydrolysis parameters with singlefactor and orthogonal tests.Results showed that the optimum condition for the enzymatic hydrolysis was as follows: substrate concentration 1.5%，enzyme dose 4500U/g，pH6.5，temperature 45℃，and time 3h.Under the optimum condition，the DPPH free radical scavenging rate was 58.82%，the hydroxyl radical scavenging rate was 34.78%.

rice barn protein;bienzyme hydrolysis;antioxidant activity

TS201.2+1

A

1002－0306(2011)12－0206－04

2011－07－25 *通訊聯(lián)系人

梅德軍(1985－)，男，碩士研究生，研究方向:農(nóng)產(chǎn)品精深加工。