益生菌Lactobacillus helveticus 130B4在牛乳中的生長特性及其促長因子研究

李艷，栗永樂，李傳娟，李秀麗，雙全，宮本拓

（1．內蒙古農業大學食品科學與工程學院，呼和浩特010018；2．岡山大學大學院自然科學研究科，日本岡山700-8530）

益生菌Lactobacillus helveticus 130B4在牛乳中的生長特性及其促長因子研究

李艷1，栗永樂1，李傳娟1，李秀麗1，雙全1，宮本拓2

（1．內蒙古農業大學食品科學與工程學院，呼和浩特010018；2．岡山大學大學院自然科學研究科，日本岡山700-8530）

將具有ACE抑制活性的乳酸菌Lactobacillus helveticus 130B4用于發酵乳制品中，研究其在還原脫脂乳中的生長特性，并探討通過添加生長促進物質對Lactobacillus helveticus 130B4生長特性以及對ACE抑制活性的影響。結果表明,Lb.helveticus 130B4菌株在還原脫脂乳培養基中生長較緩慢，產酸能力較弱，37℃培養36 h后的pH值為4.31，酸度達0.8%，活菌數為8.93 g-1；72 h后的pH值為3.45，酸度可以達到1.85%，活菌數達9.1g-1；酵母浸膏、大豆肽、核酸關聯物質對該菌株的產酸能力有一定的促進作用。

發酵乳；Lactobacillus helveticus 130B4；ACE抑制活性

0 引言

近年來發酵乳制品的醫療保健作用日益受到關注，研究發現多種發酵乳制品具有降血壓，抑制腫瘤等生理功能。在眾多的乳酸菌中，瑞士乳桿菌(Lb.helveticus)有較強的蛋白水解活性，能水解乳蛋白產生多種活性肽，其發酵乳具有較高的抗高血壓、抑制腫瘤、降低膽固醇等作用[1，2]。

血管緊張素轉換酶（ACE）可以切除血管緊張素I的羧端His-Leu二肽，形成升血壓活性較強的多肽——血管緊張素II[3]，ACE將具有降壓功能的舒緩激肽降解,使之失去降壓作用[4]。而降壓肽能夠抑制ACE的活性，使血管舒張,起到降血壓作用[5]。本文將Lb.helveticus 130B4菌株用于發酵乳制品，探討了其在還原性脫脂乳的生長特性，并通過添加促長因子對Lb.helveticus 130B4生長特性以及對ACE抑制活性的影響進行研究，為生產降血壓的瑞士乳桿菌發酵乳奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 菌株與試劑

菌株Lb.helveticus 130B4。

脫脂乳粉；血管緊張素轉化酶(Angiotensin Converting Enzyme，ACE)、馬尿酰組氨酰亮氨酸（Hippuryl-L-Histidyl-L-Leucine，HHL）及鄰苯二甲醛（o-phthaldialdehyde,OPA）；酵母浸膏，大豆肽，核酸關聯物質（腺嘌呤、鳥嘌呤、尿嘧啶和黃嘌呤）；其他化學試劑均為國產分析純。

1.2 菌株的活化和發酵乳的制備

將瑞士乳桿菌凍干粉在無菌操作條件下，接種到MRS液體培養基中，37℃培養至渾濁，并轉接3次進行活化。

將活化好的菌種轉接100 g/L(質量濃度)的滅菌脫脂乳中；37℃培養0，12，24，36，48，72 h后分別取樣測定其pH值、滴定酸度、活菌數蛋白水解活力和ACE抑制率。

1.3 活菌數測定

采用平板菌落計數法[6]。

1.4 pH值的測定

用經過標準緩沖溶液標定的實驗室PHSJ-4A型pH計進行測定。

1.5 酸度的測測定

采用NaOH滴定法[7]。

1.6 Lb.helveticus 130B4的蛋白質分解活性

蛋白質分解活性是指脫脂乳培養基中通游離的表皮生長因子的氨基酸和寡肽的增加量，參考Church的鄰苯二甲醛（OPA）方法[8]

1.7 Lb.helveticus 130B4的ACE抑制活性性

測定參照在Cushman等[9]方法并根據具體情況進行了一定的修改，具體方法如下：

取40 μL樣品，與濃度為10 mmol/L的HHL作底物的0.1 mol/L硼酸緩沖液（濃度為0.3 mol/L的NaCl,pH值為8.3）40 μL混合，在(37士0.5)℃恒溫水浴中預熱3 min,后加人40 μL ACE酶液（0.01 U/mL），將混合液在37℃保溫30 min,然后在沸水浴中加熱10 min，再加入180 μL濃度為0.01 mol/L的EDTA溶液。同時用40 μL的硼酸緩沖液（pH值為8.3）替代抑制劑溶液作為空白對照組。HPLC色譜分析條件：4.6 mm×150 mm ZORBAX-C18柱；檢測波長為228 nm；流速為1.5 mL/min；上樣量：20 μL，自動進樣；洗脫液：超純水-乙腈(75%:25%，各含0.3%的冰醋酸)；柱溫為30℃。ACE受到抑制會使馬尿酸的產量減少，以馬尿酸產量相對于空白實驗減少的百分率代表ACE抑制活性。ACE抑制活性計算公式為

ACE抑制活性=〔（Cc-Cs）/(Cc-Cb)〕×100%，

式中：Cc為不含樣品，但含有ACE溶液中馬尿酸的峰面積，即對照；Cs為含有樣品和ACE溶液中馬尿酸的峰面積；Cb為樣品與ACE都不存在時溶液中馬尿酸的峰面積，即空白。抑制50%的ACE活性所需抑制劑的濃度記為IC50

1.8 Lb.helveticus 130B4促長因子的探討

據報道在脫脂乳培養基中添加氨基酸和核酸關聯物質時可以促進乳酸桿菌的生長[10，11]。本文選擇氨基酸和寡肽含量較多的酵母浸粉、大豆肽以及腺嘌呤、鳥嘌呤、尿嘧啶、黃嘌呤等核酸關聯物質按一定量分別添加到脫脂乳培養基中，接種Lb.helveticus 130B4后測定不同發酵階段的pH、酸度、蛋白質分解活性和ACE抑制活性。

2 結果與討論

2.1 Lb.helveticus 130B4還原脫脂乳的生長特性

將Lb.helveticus 130B4在MRS液體培養基中進行3代活化后，按1.0%的量接種到10%的還原脫脂乳，在37℃的溫度下進行培養。在培養0，12，24，36，48，72 h后對其pH值、滴定酸度、活菌數進行檢測，結果如圖1所示。

圖1 Lb.helveticus 130 B4還原脫脂乳的生長特性

圖1中，Lb.helveticus 130B4菌株在還原脫脂乳培養基中生較緩慢，在培養到24 h的時候，pH值為5.20，生成底物酸度僅為0.39%，培養至36 h的酸度達0.8%，72 h后可以達到1.85%。

2.2 Lb.helveticus 130B4生育性及添加促長因子的影響

將活化了的Lb.helveticus 130B4菌種分別接種到質量分數為1.0%酵母浸膏、1.0%大豆肽和5 g/100 L核酸關聯物質（腺嘌呤、鳥嘌呤、尿嘧啶、黃嘌呤）的10%還原脫脂乳培養基中，在37℃培養0，12，24，36，48，72 h后對其pH值、滴定酸度變化，結果如圖2和圖3所示。

由圖2和圖3可以看出，酵母浸粉、大豆肽添加到質量分數為10%還原脫脂乳培養基中，可以促進Lb.helveticus 130B4的生酸性。如，培養24 h后pH值為5.2，酸度為0.39%；添加酵母后pH值為4.85，酸度為0.62%；大豆肽添加后pH值為4.68，酸度為0.96%。這種酵母和大豆肽中含有游離的氨基酸和寡肽類活性物質，可以提供Lb.helveticus 130B4增殖所需的營養成份。在培養了48 h后，添加了酵母和大豆肽的培養液和沒有添加的是有一定的區別的。

圖2 Lb.helveticus 130B4的pH值及添加促長因子的影響

圖3 Lb.helveticus 130B4的生酸性及添加促長因子的影響

核酸關聯物質包括腺嘌呤（Adenine）、鳥嘌呤（Guanine）、尿嘧啶（Uracil）、黃嘌呤（Xanthine），黃嘌呤對Lb.helveticus 130B4的生長有明顯的促進作用。對照培養24 h和培養36 h圖示的pH值和酸度有較大的差別。在Lb.helveticus 130B4培養的初期階段，其蛋白的分解能力較弱，黃嘌呤的生長促進作用也較弱，培養48 h后，以降解瑞士乳桿菌而分解生成生長的必要物質十分充足，因而反應也趨于完善。

2.3 Lb.helveticus 130B4的蛋白質分解活性

使用Lb.helveticus 130B4菌株，將質量濃度為5 g/100 L的腺嘌呤（Adenine）、鳥嘌呤（Guanine）、尿嘧啶（Uracil）、黃嘌呤（Xanthine）4種核酸關聯物質、質量分數為1.0%的酵母浸粉和1.0%的大豆肽分別添加到質量分數為10%的還原脫脂乳培養基中進行接種，培養12，24，36，48，60，72 h后，測定得到的氨基酸、寡肽類物質質量分數變化如圖4所示。

由圖4可以看出，24 h之內，由于添加的酵母和大豆肽中含有游離的氨基酸和寡肽類活性物質，所以吸光值較添加核酸關聯物質高,培養12 h后，在培養基中添加了腺嘌呤、黃嘌呤后產生的氨基酸和寡肽類物質含量急速增加，24 h到36 h時間內則都以倍數增加。酵母浸粉、大豆肽及核酸關聯物質加入Lb.helveticus 130B4菌株的發酵乳中，其產生的分解活性可以促進的Lb.helveticus 130B4分解。其中，黃嘌呤對Lb.helveticus 130B4分解活性有較強的促進作用。

2.4 Lb.helveticus 130B4的ACE抑制活性

具有ACE抑制活性也是Lb.helveticus 130B4重要特性之一，由于黃嘌呤對Lb.helveticus 130B4的生長特性有較強的促進性，所以添加質量濃度為5 g/100 L黃嘌呤到10%還原脫脂乳培養基中，Lb.helveticus 130B4的ACE抑制活性的調節結果如圖5所示。

由圖5可以看出，還原脫脂乳培養基中添加黃嘌呤后，ACE制活性明顯增強，在培養48 h活性達到64.27%，比沒添加時ACE抑制活性提高了14.75%。添加黃嘌呤可使乳酸菌的蛋白質分解能力增強，發酵乳中的游離氨基酸和寡聚肽的含量增多，培養液中具有ACE抑制活性的短肽含量也隨之增多。

圖4 游離氨基酸、肽類質量分數的變化（OD）

3 結論

圖5 Lb.helveticus 130B4的ACE抑制活性

將Lb.helveticus 130B4菌株接種于還原性脫脂乳培養基中，在37℃下培養，生長較緩慢，產酸能力較弱，36 h后的pH值為4.31，酸度達0.8%，活菌數8.93 g-1；72 h后的pH值為3.45，酸度可以達到1.85%，活菌數達9.1g-1；酵母浸粉、大豆肽、核酸關聯物質對該菌株的產酸能力有一定的促進作用。發酵液中游離氨基酸含量明顯較沒添加時增多，24 h到36 h時間內則都以倍數增加；還原脫脂乳培養基中添加黃嘌呤后，ACE抑制活性明顯增強，在培養48 h活性達到64.27%，比沒添加時ACE抑制活性提高了14.75%。

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Study on the growth characteristics and promoting growth factors of probiotic Lactobacillus helveticus 130B4 in milk

LI Yan1,LI Yong-le1,LI Chuan-juan1,LI Xiu-li1,SHUANG Quan1,MIYAMOTO TAKU2
(1.College of Food Science and Engineering,Inner Mongolia Agricultural University,Huhhot 010018,China；2.Okayama University School of Natural Science and Technology Japan Okayama 700-8530）

ACE inhibitory activity of lactic acid bacteria Lactobacillus helveticus 130B4 was used in fermented dairy products,in order to reseach the growth characteristics,the growth characteristics and ACE inhibitory activity of Lactobacillus helveticus 130B4 were studied by the addition of growth promoting substances.The results showed that Lb.helveticus 130B4 in skim milk was growing slowly and weak acid,37℃for 36 h,the pH was 4.31,the acidity was 0.8%,the viable count was 8.93 g-1;after 72 h,the pH was 4.31,the acidity was 1.85%,the viable count was 9.1 g-1;the acid production ability of this strain could be promoted by Yeast leaching powder、Soybean peptide and nucleic acid related material

fermented milk；Lactobacillus helveticus 130B4；ACE inhibitory activity

Q935

A

1001-2230（2011）02-0006-03

2010-10-22

李艷（1984-），女，碩士，從事乳品生物技術方面的研究。通訊作者：雙全