具有潛在抑制腸道致病菌的乳酸菌的篩選

張英春，張蘭威，韓雪，易華西，杜明，妥彥峰，李靖妍

(1.哈爾濱工業大學食品科學與工程學院，哈爾濱150090；2.新疆塔里木大學生命科學學院，新疆阿拉爾843300）

具有潛在抑制腸道致病菌的乳酸菌的篩選

張英春1，張蘭威1，韓雪1，易華西1，杜明1，妥彥峰2，李靖妍1

(1.哈爾濱工業大學食品科學與工程學院，哈爾濱150090；2.新疆塔里木大學生命科學學院，新疆阿拉爾843300）

以西北地區發酵食品分離出的106株乳酸桿菌為材料，通過其代謝產物對腸道致病菌生長的抑制作用、菌體HT-29細胞的粘附作用和抑制宋內志賀氏菌（S.sonnei）對HT-29細胞的黏附作用篩選出了具有抑制腸道致病菌作用的三株乳酸桿菌，為進一步的體內實驗奠定了基礎。

乳酸桿菌；致病菌；抑制致病菌生長；抑制黏附

0 引言

乳酸桿菌是人類和動物腸道中一種正常的優勢有益菌，能夠維持腸道微環境的平衡作用[1]。研究表明乳酸桿主要是通過產生抗菌物質，競爭粘附位點等方式拮抗多種病原菌的作用[2，3]。然而通過體內實驗來篩選具有抑菌作用的乳酸桿菌不僅價格昂貴、而且耗時。因此利用可靠的體外方法篩選具有潛在抑菌活性的菌株是必要的。西北地區傳統的發酵制品中擁有豐富的乳酸桿菌資源，這些菌株來源于當地的自然環境，不僅賦予食品特有的營養價值和風味，而且具有很好的抗逆性和益生性。本研究利用乳酸桿菌體外抑制致病菌的生長、抑制致病菌對腸道上皮細胞的黏附作用[4]的實驗方法對所分離的乳酸桿菌的抑菌活性進行了體外篩選研究，為進一步的體內試驗提供數據基礎。

1 實驗

1.1 材料

1.1.1 菌株和細胞株

實驗所用的乳酸桿菌都是分離于西北地區傳統發酵制品中，主要有甘肅甘南藏族自治州（G）、甘肅肅北蒙古族自治縣（SB）、青海海北藏族自治州牧民自制的牦牛乳酸奶（Q）；新疆哈薩克族牧民自制的馬奶酒（M）及奶酪（X）；西藏拉薩地區牧民自制的奶酪（T）；蘭州市民自制的發酵蔬菜汁漿水，分純的乳酸菌經過革蘭氏染色、過氧化氫酶試驗初步確定為乳酸桿菌，共計106株。指示菌株為大腸埃希菌（E.coli，ATCC25922），鼠傷寒沙門氏菌（S.typhimurium，ATCC14028），宋內志賀氏（S.sonnei，ATCC25931），HT-29細胞株。

1.1.2 試劑和儀器

MRS用于培養乳酸桿菌，TSA用于培養致病菌，RPMI1640細胞培養液，胰蛋白酶，胎牛血清，蛋白酶K，Biolog AN微生物鑒定板，6孔細胞培養板、12孔細胞培養板，雙筒電光顯微鏡，CO2培養箱。

1.2 方法

1.2.1 乳酸菌抑制致病菌的初篩

采用瓊脂擴散法測定乳酸桿菌對致病菌的抑制性[5]。將分純供試菌株活化2～3代。取1 mL的致病菌懸液（107mL-1）于滅菌的平皿中，傾入滅菌的TSA培養基，待其凝固后，用滅菌的打孔器在平皿內打孔，孔徑為5 mm，每個平皿打4個孔，然后每孔中加入50 μL的乳酸桿菌發酵液，在37℃條件下培養18 h，同時用MRS培養基做陽性對照，記錄抑菌圈的大小，與對照組相比抑菌圈直徑大于等于1 mm為陽性，每個樣品做4個平行。

1.2.2 乳酸菌的黏附性篩選

（1）HT-29細胞培養

使用RPMI1640培養液培養HT-29細胞，HT-29細胞在5%CO2培養箱里37℃培養，每48 h換液1次，連續培養15 d。將蓋玻片放在6孔組織培養板中，向孔中加入1 mL濃度為4×105mL-1的細胞培養液，每天更換細胞培養液，至到在玻璃蓋玻片上形成單層細胞。

（2）黏附實驗[6]

乳酸桿菌在MRS液體培養基中37℃培養18～20 h。取1 mL菌體培養液（108mL-1）并加入1 mL RPMI1640培養液制成2 mL細菌懸浮液。吸出6孔組織培養板中HT-29細胞培養液，用PBS緩沖液（pH值為7.4）沖洗HT-29細胞2次。然后將上述2 mL乳酸桿菌RPMI1640懸浮液加入到培養孔中。組織培養板繼續在5%CO2和95%空氣的環境中37℃培養2 h，然后將細菌懸浮液吸出，用PBS（pH值為7.4）沖洗HT-29細胞5次，然后用甲醇固定，革蘭氏染色，于100倍油鏡下鏡檢。隨機選取20個視野計數HT-29細胞所黏附的細菌數，計算每100個細胞所黏附的細菌數，作為黏附指數（AI），每株菌做2個重復。

1.2.3 初篩菌株的鑒定

綜合抑菌性和粘附性實驗結果將初篩菌株進行了鑒定。采用Biolog微生物鑒定系統提供的“Biolog AN微生物鑒定板”對7株菌進行了鑒定，主要是依據乳酸桿菌對鑒定板所提供的95種碳源的利用情況進行了屬種鑒定。

1.2.4 發酵液中抑菌物質性質的分析

本研究將篩選的7株乳酸桿菌制備上清液（Cell-Free Culture Supernatants，CFCS)，將上清液進行如下處理[7]，通過瓊脂擴散法來初步測定發生抑菌作用的主要物質，每個處理組為2 mL，每個實驗做3個平行，兩次重復。

(1)未處理的CFCS；

(2)CFCS對熱的敏感性：將CFCS加熱處理（80℃，15 min）；

(3)CFCS對蛋白酶的敏感性：CFCS中加入蛋白酶κ（200 mg/L）于37℃條件下培養3 h后備用；

(4)用濃度為10 μmol/L的NaOH將CFCS的pH值至6.5。

1.2.5 乳酸桿菌篩選[8，9]

將瓶中培養好的HT-29細胞解析下來制備成3×105的細胞懸液，接入到用12孔培養板中培養至形成單層細胞。用PBS（pH=7.4）清洗2次后，每孔中加入0.4 mL的1640培養液，然后每個孔中加入100 μL的乳酸桿菌菌懸液（1×108mL-1），在37℃和5%CO2/95%的空氣條件下分別培養1 h，然后加入100 μL的S.sonnei（1×108mL-1），在37℃和5%CO2/95%的空氣條件下繼續培養1 h。實驗結束后單層細胞用PBS洗滌4次后，加入0.5%的TritonX-100，0.5 mL，在冰水浴中解析5 min，從細胞上解析下來的菌體進行梯度稀釋后，用TSA來計數實驗組和對照組中的S.sonnei數量，對照組中只加S.sonnei，每個實驗做3個平行，5次重復。

2 結果與分析

2.1 具有抑菌能力菌株的篩選

通過對傳統發酵制品中106株乳酸桿菌的抑菌作用篩選，初步篩選出38株對3種致病菌具有不同程度的抑菌作用，如表1。另外大多數菌株對S.sonnei的抑制作用高于對E.coli和S.typhimurium的抑制作用。同比從漿水中分離的菌株，其抑菌作用更強一些，如：J21-L，J10-L和J23-L等。

2.2 具有黏附性菌株的篩選

乳酸菌能夠黏附到腸道上皮細胞是其進一步發揮作用的前提，具有較強黏附能力的乳酸桿菌在腸道定殖后，可以有效的防止病原微生物接觸和粘附腸粘膜細胞，從而預防腸致病菌引起的腸道疾病[10]。本研究將抑菌效果較好的38株菌株，采用HT-29細胞株進行了黏附實驗，結果如表1所示。菌株黏附能力的評價標準：每20個視野中菌株的數量少于50為無黏附能力；黏附的菌株數量在51～100，具有黏附能力；黏附的菌株數量超過100為強黏附能力[4]。由表1可以看出，在測定的菌株中黏附指數大于50的菌株包括SB32，SB14，SB27，M22-L，M7-L，M6-L，M20-L，Q8-L，Q2-L，M5-L，M25-L，Q6-L，Q12-L，X12-L，X2-L，G15-L，G1-L，J21-L，J10-L。結合乳酸菌株的抑菌性，最后篩選出7株乳酸桿菌。

2.3 初篩菌株的鑒定

采用Biolog微生物鑒定系統對初篩出的7株乳酸桿菌進行了鑒定，結果如表2所示。

表2中，a為根據Biolog微生物鑒定系統的要求，當SIM值＞0.5時,鑒定結果具有準確性和可靠性。b為這些傳統發酵食品采用傳統方法制作，具有獨特的風味，深受當地居民喜愛，在當地居民的膳食中占據重要地位。

2.4 乳酸桿菌發酵液中抑菌物質性質的分析

將7株乳酸桿菌的發酵液進行了不同處理后，進行了抑菌試驗，結果如表3。在結果中可以看出，當將CFCS進行蛋白酶K處理和熱處理時，并沒有影響其抑菌活性，初步可以判定這7株乳酸桿菌并沒有產生抗菌肽類物質。而當將CFCS的pH調至為6.5時，這7株乳酸桿菌的抑菌活性全部消失，初步可以確定乳酸桿菌代謝過程中產生的有機酸類發揮重要作用。資料也報到了L.casei Shirota和L.rhamnosus GG的抗菌活性主要也是由于產生有機酸的作用[3]。有機酸，特別是丁二酸，不僅對腸道致病菌起到一個屏障作用，而且對于維持腸道的健康也發揮著重要的作用[11]，另外通過本研究未能篩選出產生抗菌肽的菌株。

表1 初篩乳酸桿菌對致病菌的抑制性及其在HT-29細胞上的黏附性

表2 篩選乳酸桿菌菌株的鑒定和來源

表3 不同處理乳酸桿菌CFCS對致病菌的抑制作用

2.5 抑制S.sonnei對HT-29細胞的黏附作用菌株的篩選

圖1為乳酸桿菌抑制S.sonnei在HT-29細胞上的黏附作用。

圖1 乳酸桿菌抑制S.sonnei的黏附作用

在抑制S.sonnei對HT-29細胞的黏附性實驗中，從表1的數據統計分析中可以看出，先加入M5-L，Q8-L和J10-L乳酸桿菌菌株培養1 h后，再加入S.sonnei，S.sonnei的黏附菌數與對照組相比差異顯著（P＜0.05），而且對S.sonnei抑制率分別為55%，36.4%和38.1%。而J21-L，X12-L，Q6-L和G15-L加入后，雖然S.sonnei的黏附菌數與對照組相比也有所減少，但是統計分析差異不顯著（P＞0.05），對S.sonnei抑制率都低于30%。資料已經報到了Lactobacillus crispatus strain ZJ001能夠抑制39%和35%的E.coli和S.typhimurium對上皮細胞的粘附作用[12]。另外Candeal et al.報道[8]了菌株Lactobacillus acidophilus Bar13和L.plantarum Bar10能夠抑制腸道致病菌E.coli和S.typhimurium在Caco-2細胞上黏附，因此利用乳酸桿菌預防腸道致病菌引起的某些腸道疾病是具有一定基礎的。

3 結論

通過乳酸桿菌代謝產物體外抑制致病菌的生長和乳酸桿菌對HT-29細胞的黏附作用，初步篩選出7株乳酸桿菌L.paracasei subp.paracasei M5-L，L.rhamnosus J10-L，L.paracasei subp.paracasei J21-L，L.casei Q8-L，L.paracasei subp.paracasei X12-L，L.delbrueckii subsp.bulgaricus Q6-L和L.paracasei subp.paracasei G15-L。

通過抑制S.sonnei對HT-29上皮細胞的粘附作用研究，從7株乳酸桿菌中篩選出3株具有顯著抑制作用的菌株L.paracasei subp.paracasei M5-L，L.rhamnosus J10-L和L.casei Q8-L。為進一步的體內試驗研究提供實驗數據。

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In vitro screening of Lactobacilli strains potential to inhibition the Enteropathogens

ZHANG Ying-chun1,ZHANG Lan-wei1,HAN Xue1，YI Hua-xi1，DU Ming1，TUO Yan-feng2,LI Jing-yan1
(1.School of Food Science and Engineering,Harbin Institute of Technology,Harbin 150090,China 2.Department of Life Science,Tarim University,Alar,Sinkiang 843300,China)

By analyzing the production of antimicrobial molecules active against E.coli,S.typhimurium and S.sonnei,adherence to HT-29 cells and inhibition of S.sonnei adherence to HT-29 cells,Three lactobacilli were screened from 106 lactobacilli strains from Chinese fermented food for inhibition the enteropathogens,which could lay a foundation for further investigation in vivo

Lactobacilli;enteropathogens;inhibition the growth of enteropathogens;inhibition adhesion

Q93.331

A

1001-2230（2011）02-0009-04

2010-10-19

益生菌定向選育及其高活性制品開發關鍵技術（2007AA10 Z354）。

張英春（1975-），女，講師，研究方向為乳酸菌及其活性產物研究。

張蘭威