小動物活體成像技術的應用

朱淼鑫，姚 明

(上海市腫瘤研究所實驗病理研究室，上海 200032)

小動物活體成像技術的應用

朱淼鑫，姚 明

(上海市腫瘤研究所實驗病理研究室，上海 200032)

小動物活體成像技術在國內外得到越來越多的普及應用，極大地促進了生命科學特別是腫瘤研究的發展。本文就小動物活體成像技術的原理、標記方法和實際應用做簡單介紹。

熒光蛋白;熒光素酶;活體成像;模型，動物

活體動物體內光學成像主要采用生物發光與熒光兩種技術。生物發光是用熒光素酶基因(Luciferase)標記細胞或DNA，而熒光技術則采用綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)、紅色熒光蛋白(red fluorescent protein，RFP)等熒光報告基因和 FITC、Cy5、Cy7等熒光素及量子點(quantum dot，QD)進行標記。小動物活體成像技術是采用高靈敏度制冷CCD配合特制的成像暗箱和圖像處理軟件，使得可以直接監控活體生物體內的細胞活動和基因行為。實驗者借此可以觀測活體動物體內腫瘤的生長及轉移、感染性疾病發展過程、特定基因的表達等生物學過程。由于具有更高量子效率CCD的問世，使活體動物體內光學成像技術具有越來越高的靈敏度，對腫瘤微小轉移灶的檢測靈敏度極高;另外，該技術不涉及放射性物質和方法，非常安全。因其操作極其簡單、所得結果直觀、靈敏度高、實驗成本低等特點，在剛剛發展起來的幾年時間內，已廣泛應用于生命科學、醫學研究及藥物開發等方面［1～3］。

1 小動物活體成像概述

1.1 熒光發光成像

熒光成像的標記對象較為廣泛，可以是動物、細胞、微生物、基因，也可以是抗體、藥物、納米材料等。常用的有綠色熒光蛋白(GFP)、紅色熒光蛋白(DsRed)及其它熒光報告基團，標記方法與體外熒光成像相似，熒光成像具有費用低廉和操作簡單等優點［4］。同生物發光在動物體內的穿透性相似，紅光的穿透性在體內比藍綠光的穿透性效率高，近紅外熒光為成像觀察的最佳選擇。

雖然熒光信號遠遠強于生物發光，但非特異性熒光產生的背景噪音使其信噪比遠遠低于生物發光。雖然許多公司采用不同的技術分離背景光，但是受到熒光特性的限制，很難完全消除背景噪音。這些背景噪音造成熒光成像的靈敏度較低。目前大部分高水平的文章還是應用生物發光的方法來研究活體動物體內成像。但是，熒光成像有其方便，直觀，標記靶點多樣和易于被大多數研究人員接受的優點，在一些植物分子生物學研究和觀察小分子體內代謝方面也得到應用。對于不同的研究，可根據兩者的特點以及實驗要求，選擇合適的方法。例如利用綠色熒光蛋白和熒光素酶對細胞或動物進行雙重標記，用成熟的熒光成像技術進行體外檢測，進行分子生物學和細胞生物學研究，然后利用生物發光技術進行動物體內檢測，進行活體動物體內研究。

熒光發光是通過激發光激發熒光基團到達高能量狀態，而后產生發射光。考慮到不同熒光物質的發射光譜EX(excitation spectrum)和激發光譜EM(emission spectrum)的不同，要選擇對應的激發和發射濾片。常用熒光蛋白和熒光染料的激發和發射波長見表1。

表1 常用熒光蛋白和熒光染料的激發和發射波長Tab.1 Common fluorescent protein and fluorescence dyes excitation and emission wavelength

1.2 生物發光成像

活體生物熒光成像技術是指在小的哺乳動物體內利用報告基因-熒光素酶基因表達所產生的熒光素酶蛋白與其小分子底物熒光素在氧、Mg2+離子存在的條件下消耗ATP發生氧化反應，將部分化學能轉變為可見光能釋放。然后在體外利用敏感的CCD設備形成圖像。熒光素酶基因可以被插入多種基因的啟動子，成為某種基因的報告基因，通過監測報告基因從而實現對目標基因的監測［5］。

生物熒光實質是一種化學熒光，螢火蟲熒光素酶在氧化其特有底物熒光素的過程中可以釋放波長廣泛的可見光光子，其平均波長為560 nm(460～630 nm)，這其中包括重要的波長超過600 nm的紅光成分。在哺乳動物體內血紅蛋白是吸收可見光的主要成分，能吸收中藍綠光波段的大部分可見光;水和脂質主要吸收紅外線，但其均對波長為590～800 nm的紅光至近紅外線吸收能力較差，因此波長超過600 nm的紅光雖然有部分散射消耗但大部分可以穿透哺乳動物組織被高靈敏的CCD檢測到。

生物發光成像的優點可以非侵入性，實時連續動態監測體內的各種生物學過程，從而可以減少實驗動物數量，及降低個體間差異的影響;由于背景噪聲低，所以具有較高的敏感性;不需要外源性激發光，避免對體內正常細胞造成損傷，有利于長期觀察;此外還有無放射性等其他優點。然而生物發光也有自身的不足之處：例如波長依賴性的組織穿透能力，光在哺乳動物組織內傳播時會被散射和吸收，光子遇到細胞膜和細胞質時會發生折射，而且不同類型的細胞和組織吸收光子的特性也不盡相同，其中血紅蛋白是吸收光子的主要物質;由于是在體外檢測體內發出的信號，因而受到體內發光源位置及深度影響;另外還需要外源性提供各種熒光素酶的底物，且底物在體內的分布與藥動力學也會影響信號的產生;由于熒光素酶催化的生化反應需要氧氣、鎂離子及 ATP等物質的參與，受到體內環境狀態的影響。

2 細胞轉染方法

以移植性小鼠腫瘤模型活體成像為例，一個完整的成像過程包括構建報告基因、細胞轉染和篩選、建立穩定表達的細胞、再將此細胞在體內建立相應的動物模型，進而通過小動物活體成像系統檢測動物體內特定部位所發出的光子信號，最后通過計算機圖像處理軟件獲得量化數據和實驗圖像。也就是說，選擇合適的報告基因與轉染方法至關重要。

熒光蛋白表達質?？梢宰约簩嶒炇覙嫿?，也可以來源于其它實驗室惠贈或市售。本文采用的真核表達質粒eGFP-2A-CBGr99由德國癌癥研究中心Haemmerling教授惠贈，全長5929 bp，屬氨芐青霉素抗性選擇系統，帶有細菌的氨芐青霉素抗性基因Amp，在CMV啟動子驅動下可在真核細胞中表達，產物為 GFP與 Luciferase雙表達［6］。細胞轉染方法包括DEAE-葡聚糖法，磷酸鈣法，陽離子脂質體法，陽離子聚合物法，病毒介導法，Biolistic顆粒傳遞法(基因槍粒子轟擊法)，顯微注射法，電穿孔法等，本文介紹比較常用的陽離子脂質體法和病毒介導法。2.1 陽離子脂質體法

2.1.1 細胞準備：轉染前1 d將待轉染細胞鋪24孔板，每孔大約 l×105個細胞，預計轉染時細胞達50% ～80%融合。

2.1.2 脂質體/質粒復合物的制備：1 μg質粒稀釋于100 μL不含血清及抗菌素的 DMEM培養液中，輕輕混勻;10 μL的脂質體轉染試劑稀釋于100 μL DMEM中，輕輕混勻;將100 μL脂質體轉染試劑稀釋液滴加到質粒稀釋液中，一邊滴加一邊混勻;室溫孵育30 min;將200 μL脂質體/質粒復合物添加到每孔中并輕輕搖動使之混合;放置在37℃ 5%CO2孵育箱孵育36 h后，在熒光顯微鏡下觀察轉染效率。轉染后一般隔天換液，培養液為含有 G418的DMEM培養基，以篩選抗性克隆，所含G418濃度從400 mg/L開始。視情況每次換液時G418濃度增加(200～400)mg/L，到最高達 2000 mg/L，2～3周后熒光顯微鏡下挑選最亮克隆，將細胞克隆擴增，可得GFP表達純度約為50% ～60%的細胞株，取少量細胞進一步在6孔板中培養，每孔約10個細胞，待長成克隆后再挑選單個表達GFP的細胞生成的克隆即可得到高純度的GFP陽性細胞株。

2.2 慢病毒感染法

2.2.1 質粒制備

2.2.1.1 質粒準備：收到溶解于濾紙上的質粒eGFP-2A-CBGr99后，用剪刀剪下含有質粒的濾紙部分，放入一個1.5 mL Eppendorf管中，然后加入50 μL滅菌去離子水至此管中，充分溶解后，12000 r/min，離心5 min，轉移上清液至另一個 Eppendorf管，-20℃保存。

2.2.1.2 質粒轉化：取1.5 μL上述質粒加入到50 μLTop10感受態細菌中;放入冰中30 min;42℃ 熱休克90 s;快速的將Eppendorf管移到冰中，冷卻1～2 min;加入1 mL新鮮 LB培養液，37℃，搖床 ＜50 r/min，振蕩 45 min，主要使 Amp基因表達;4000 r/min，離心5 min，超凈臺中將 Eppendorf管中的上清液吸去一部分，并反復吹打，使感受態細胞懸浮;將懸浮液用涂布棒均勻的涂布到含50 μg/mL Amp的1.5%的瓊脂板上。平板倒置，37℃培養過夜(12～16 h);以無菌牙簽挑取含氨芐青霉素瓊脂平板上的單菌落，接種到5 mL含氨芐青霉素的LB培養基中，在37℃，220 r/min振搖培養過夜;取1 mL過夜培養液加入 1.5 mL Eppendorf管中，10000 r/min離心2 min，棄0.3 mL上清液，并加入0.3 mL甘油到此含有細菌的離心管中，混勻后放入-70℃冰箱中保存。

2.2.1.3 質粒抽提：將含質粒eGFP-2A-CBGr99的甘油菌以1∶1000接種到5 mL含氨芐青霉素的LB培養基中，37℃，220 r/min振搖培養過夜。采用質粒小量抽提試劑盒進行小量抽提質粒，具體方法如下：取1.5 mL細菌培養物加入到1.5 mL Eppendorf管中，12000 r/min離心2 min;棄掉上清液后，加入100 μL Solution I，反復吹打至菌體充分懸浮，室溫下靜置1 min;加入 200 μL Solution II，輕輕顛倒 5次，室溫下靜置 1 min;加入 350 μL Solution III，輕輕顛倒5次，室溫下靜置1 min;12000 r/min離心5 min;轉移上清液至層析柱中，10000 r/min離心2 min;棄掉收集液，加入 500 μL Wash Solution，10000 r/min離心2 min;棄掉收集液，再加入500 μL Wash Solution，10000 r/min 離心 2 min;棄掉收集液，10000 r/min離心1 min;棄掉殘留的收集液，轉移層析柱到另一個 1.5 mL Eppendorf中，加入 50 μL Elution Buffer至層析柱中央區域，室溫孵育2 min，10000 r/min離心2 min，保留收集液，分別取出一部分質粒溶液進行后續分析(包括電泳、濃度及純度、酶切鑒定等)，剩下的質粒溶液-20℃保存。

2.2.1.4 質粒濃度測定及酶切電泳分析：取5 μL抽提的質粒進行1%agarose膠電泳，檢測質粒大小，應為5929 bp;取2 μL抽提的質粒加入到78 μL去離子水中，1∶20稀釋后應用核酸定量儀測定其A260及A280，以檢測質粒濃度及純度;用兩種內切酶HindⅢ 及 XhoⅠ進行雙酶切鑒定，若為正確的克隆，則可被切出一個2731 bp及一個3198 bp片段。

2.2.2 慢病毒載體構建

2.2.2.1 pWPXL-eGFP-2A-CBGr99質粒的構建：將質粒eGFP-2A-CBGr99與pWPXL載體質粒分別經BamH I和Xba I雙酶切，37℃酶切3 h。1.2%瓊脂糖凝膠電泳后，切膠回收目的DNA片段和酶切后的pWPXL載體片段;將回收的目的 DNA片段和pWPXL載體片段，用T4連接酶進行連接，16℃水浴過夜;連接產物轉化Top10感受態細菌，挑選陽性克隆擴增培養。離心收集細菌并抽提重組質粒。所提取的質粒用BamHⅠ和XbaⅠ進行酶切鑒定;將酶切鑒定正確的重組質粒進行擴增培養，并制備少量質粒送Invitrogen公司測序。測序正確后，命名為pWPXL-eGFP-2A-CBGr99;大量提取質粒 pWPXL-eGFP-2A-CBGr99。同時大量提取質粒 pA2和pMDG2，準備轉染細胞之用;

2.2.2.2 慢病毒載體的包裝：應用 Lipofectamine 2000介導的細胞轉染方法將三個質粒(重組質粒pWPXL-eGFP-2A-CBGr99，包裝質粒 pA2和包膜質粒pMDG2)共同轉染 293T細胞。第 1天：接種2.5×106293T細胞至1個10 cm培養皿中;第2天：轉染前半小時，將培養皿中的培養液換成無血清無抗生素 DMEM。將 12 μg重組質粒載體 pWPXL-eGFP-2A-CBGr99，9 μg 包裝質粒 pA2 及 3.6 μg 包膜質粒 pMDG2加入 DMEM至 1.5 mL，混勻;將60 μL Lipofectamine 2000 加入 DMEM 至 1.5 mL，混勻;靜置5 min后，將兩者混勻，室溫放置 20～25 min，滴加入培養皿中。6～8 h后，更換培養基，加入新鮮培養基9 mL，繼續培養;第3天：熒光顯微鏡觀察轉染效率;第4天：收集培養基，3000 r/min室溫離心5 min，0.45 μm濾膜抽濾。病毒可直接用于感染或-70℃保存。

2.2.2.3 慢病毒滴度測定(用293T細胞測定)：第1天：2.0×105293T細胞鋪在6孔板內，加入完全培養基進行培養;第2天：換液，每孔加入新鮮完全培養基。消化其中一個孔中的細胞并進行計數。其余各孔每孔均加入多聚賴氨酸(Sigma)，使其終濃度為6 μg/mL。30 min后，加入病毒(病毒量按梯度加入，如 10 μL，50 μL，100 μL，200 μL 四個梯度);第3天：用完全培養基換液;第4天：熒光鏡下觀察表達 GFP細胞。消化細胞，加入2 mL PBS，1000 r/min離心5 min;用0.5 mL PBS重懸細胞，把細胞置于冰上或冰箱中準備分析。用流式細胞儀檢測GFP+細胞數目，根據下列公式計算病毒滴度：滴度 =［%GFP+Cells］［day 2 cell count(cells/mL)］/volume of virus added(mL)

2.2.3 慢病毒感染

2.2.3.1 鋪板：消化細胞：將1個10 cm培養皿細胞胰酶消化后，轉移一部分細胞懸液至1個5 mL離心管中，1500 r/min，離心 4 min，去除上清液，并用1 mL完全培養液重懸;計數并調整細胞懸液濃度：分別取50 μL上述準備的細胞懸液加入到450 μL無血清培養液中，10倍稀釋后進行計數，并根據計數結果用完全培養液調整細胞懸液濃度;上述準備的細胞懸液加入到1塊6孔板中的1個孔中，并用完全培養液補足體積至0.6 mL，混勻后，放入37℃培養箱中繼續培養。

2.2.3.2 慢病毒感染：第2天：昨日鋪板的1塊6孔板，棄掉各孔中舊培養基，加入新鮮完全培養基，各孔中再加入多聚賴氨酸(終濃度為6 μg/mL)，放入培養箱中繼續培養。30 min后，6.0×106單位病毒加入到各個孔中;第3天，棄掉各孔中的含病毒的培養基，加入新鮮完全培養基，繼續培養;第4天，在熒光顯微鏡下觀察轉染的各孔中細胞表達GFP情況。

2.2.4 流式細胞分選穩定表達GFP細胞

2.2.4.1 消化細胞：上述經過慢病毒感染后的細胞1個10 cm培養皿，經胰酶消化，1%FBS DMEM吹打分散后，全部轉移至1個5 mL離心管中，1500 r/min，離心4 min，去除上清液，并用2%FBS DMEM培養液重懸，并轉移至流式分選樣品管中，4℃放置，備用。準備2個15 mL離心管，分別加入7 mL 10%FBS DMEM，準備收集細胞之用。

2.2.4.2 細胞分選：應用流式細胞儀的分選模式分選并收集GFP陽性表達細胞;

2.2.4.3 細胞擴增：分選結束后，將上述15 mL離心管，2000 r/min，離心4 min;棄掉上清液后，加入1 mL完全培養基重懸，分別轉移至1個10 cm培養皿中，繼續擴增培養。

3 小動物活體成像

3.1 制作動物模型

可根據實驗需要通過尾靜脈注射、皮下移植、原位移植等方法接種已標記的細胞或組織。在建模時應認真考慮實驗目的和選擇熒光標記，如標記熒光波長短，則穿透效率不高，建模時不宜接種深部臟器和觀察體內轉移，但可以觀察皮下瘤和解剖后臟器直接成像。深部臟器和體內轉移的觀察大多選用熒光素酶標記［7］。

3.2 活體成像

小鼠經過常規麻醉(氣麻、針麻皆可)后放入成像暗箱平臺，軟件控制平臺的升降到一個合適的視野，自動開啟照明燈(明場)拍攝第一次背景圖。下一步，自動關閉照明燈，在沒有外界光源的條件下(暗場)拍攝由小鼠體內發出的特異光子。明場與暗場的背景圖疊加后可以直觀的顯示動物體內特異光子的部位和強度，完成成像操作。值得注意的是熒光成像應選擇合適的激發和發射濾片，生物發光則需要成像前體內注射底物激發發光。

3.3 數據處理

小動物活體成像圖像處理軟件除了提供含有光子強度標尺的成像圖片外，還能計算分析發光面積、總光子數、光子強度的相關參數供實驗者參考。

3.4 實驗影響因素

原則上，如預實驗時拍攝出圖片非特異性雜點多，需降低曝光時間;反之，如信號過弱可適當延長曝光時間。但曝光時間的延長，不僅增加了目的信號，對于背景噪音也存在一個放大效應。同一批實驗應保持一致的曝光時間，同時還應保持標本相對位置和形態的一致，從而減少實驗誤差。

進行熒光成像時，實驗者可選擇背景熒光低不容易反光的黑紙放在動物標本身下，減少金屬載物臺的反射干擾。動物體內很多物質在受到激發光激發后，會發出熒光，產生的非特異性熒光會影響到檢測靈敏度。背景熒光主要是來源于皮毛和血液的自發熒光，皮毛中的黑色素是皮毛中主要的自發熒光源，其發光光線波長峰值在500～520 nm左右，在利用綠色熒光作為成像對象時，影響最為嚴重，產生的非特異性熒光會影響到檢測靈敏度和特異性。動物尿液或其他雜質如沒有及時清除，成像中也會出現非特異性信號。

由于各廠商的圖像分析軟件不同，實驗數據分析方法也有區別?；铙w成像系統使用時，實驗者考慮到非特異性雜信號，以及成像圖片美觀等方面，可能會調節信號的閾值，因此在分析信號光子數或信號面積時，應考慮閾值的改變對實驗結果的影響。正確選擇ROI區域，可提高分析實驗數據的準確性。

4 展望

小動物活體成像技術具有靈敏度高、直觀、操作簡單、能同時觀測多個實驗標本，相比 PET、SPECT無放射損害等優點，但也有其自身的缺陷，例如動物組織對光子吸收、空間分辨率較低等問題，因而仍需不斷地完善和改進。小動物活體成像按成像性質屬于功能成像，如何能更好地與結構成像技術(microCT、超聲等)相結合，使實驗結果不但能夠定量，而且還能精確定位，這是活體成像技術今后的發展方向之一［8］。

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［3］ Hardy J，Francis KP，DeBoer M，et al.Extracellular replication of Listeria monovytogenes in the Murine gall bladder［J］.Science，2004，303：851-853.

［4］ 閆明霞，劉蕾，莢德水，等.人肺癌裸小鼠模型活體成像的動態觀察［J］.腫瘤，2008，28(10)： 204-208.

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In Vivo Imaging Technology in Small Animal

ZHU Miao-xin，YAO Ming
(Department of Experimental Pathology，Shanghai Cancer Institute，Shanghai 200032，China)

Small animal in vivo imaging technology at home and abroad is more and more popular，which greatly promoted the life sciences，especially cancer research.This article describes the in vivo small animal imaging principles，methods and practical applications.

Fluorescent protein;Luciferase;In vivo imaging;Model，Animal

R-33 R332

B

1671-7856(2011)03-0001-05

2010-05-10

10.3969/j.issn.1671.7856.2011.03.001

本文由高誠教授推薦。