不同脫毒方法對玉米秸稈水解液酒精發酵的影響

張 強 ，Anders Thygesen，Anne Belinda Thomsen

（1長春理工大學生命科學技術學院，吉林 長春 130022；2Biosystems Division，Ris? DTU，Technical University of Denmark，Denmark）

研究開發

不同脫毒方法對玉米秸稈水解液酒精發酵的影響

張 強1，Anders Thygesen2，Anne Belinda Thomsen2

（1長春理工大學生命科學技術學院，吉林 長春 130022；2Biosystems Division，Ris? DTU，Technical University of Denmark，Denmark）

利用濕熱預處理（195 ℃，15 min）后的玉米秸稈水解液，考察了3種不同脫毒方法（中和法、飽和生石灰法和Na2SO3法）對水解液中的抑制劑的去除效果，研究了樹干畢赤酵母（Pichia stipitis58376）對脫毒后的水解液酒精發酵情況。結果表明：玉米秸稈水解液經過 3種方法脫毒處理后，醛類抑制劑（糠醛和 5-羥甲基糠醛）平均減少41%，總酚類最高去除28.4%，酒精得率都得到明顯提高。最佳的脫毒方法是飽和生石灰法，理論酒精得率達到69.31%，對應的酒精濃度和生產效率分別為12.2 g/L和0.056 g/(L·h)。飽和生石灰法是一種有效實用的脫毒方法。

玉米秸稈；濕熱預處理；脫毒；樹干畢赤酵母

世界原油儲量的日益下降，使得人們對探索新的可再生能源產生了極大的興趣。利用豐富廉價的玉米秸稈等纖維質原料生產燃料酒精不但可緩解能源危機，而且可大大降低二氧化碳的排放，減輕環境污染[1-2]。

玉米秸稈主要由纖維素、半纖維素和木質素構成，結構致密。濕熱預處理是一種有效的預處理方法，可使纖維素和半纖維素有效分離[3]。預處理后的水解液由于含有豐富的還原糖等營養物質是酒精發酵很好的原料，但預處理過程中由于糖類及木質素的降解，會釋放一些微生物生長的抑制劑，例如糠醛、5-羥甲基糠醛（5HMF）以及酚類等物質，從而影響菌體發酵[4-5]，尤其樹干畢赤酵母（Pichia stipitis）對抑制劑非常敏感，往往不能夠進行發酵。抑制劑的種類和數量與原料和預處理條件有關。因此發酵之前應進行必要的脫毒處理。目前使用的脫毒方法較多，其中飽和生石灰法和Na2SO3法是常用的有效的脫毒方法，廣泛應用于各種水解液的脫毒處理[6-7]，而中和法是比較簡單易行的脫毒方法。但由于原料、預處理方式以及發酵微生物不同，各種脫毒方法之間難于進行比較。

本文主要考察了3種脫毒方法——中和法、飽和生石灰法和 Na2SO3法對玉米秸稈水解液中抑制劑的去除效果，并利用樹干畢赤酵母（Pichia stipitis58376）對脫毒后的水解液酒精發酵進行了研究。

1 材料與方法

1.1 菌種和細胞生物量

樹干畢赤酵母（Pichia stipitis58376）購買后保存在丹麥瑞素國家實驗室。首先 30 ℃培養過夜，然后3000 r/min離心5 min，重新懸浮在無菌水中作為發酵種子備用。菌體離心，105 ℃干燥至恒重進行細胞生物量測定[8]。

1.2 原料

玉米秸稈來自意大利，2004年7月份收獲，首先經過氣流干燥，然后粉碎成粒徑為1 mm備用。

1.3 水解液樣品制備

濕熱預處理是在丹麥瑞素國家實驗室環行高壓容器中進行的。本實驗所采用的實驗條件是基于前期所做的玉米秸稈濕熱預處理的基礎上進行的。195 ℃，預處理15 min是已報道的最佳條件[9]。將60 g玉米秸稈原料（絕干）與1 L水混合，195 ℃預處理15 min，反應結束后，將預處理液過濾處理并添加適量葡萄糖作為水解液樣品。

1.4 脫毒方法

1.4.1 中和法

利用 Ca(OH)2將玉米秸稈水解液 pH值調到5.5，靜置1 h后過濾。

1.4.2 飽和生石灰法

采用飽和石灰石乳液與玉米秸稈水解液快速攪拌混合，首先將pH值調到10.0，靜置1 h后過濾，然后用濃H2SO4酸化到pH值5.5，靜置過濾。

1.4.3 Na2SO3法

將 1.4.2節處理好的水解液加入 Na2SO3（3 g/L），靜置1 h后過濾。

1.5 水解液的組成分析

水解液中醛類及還原糖（葡萄糖、木糖）由液相色譜（HPLC）測得。柱子為 Aminex HPX-87H（BIO-RAD），溫度63 ℃，流動相4 mol/L H2SO4，流速0.6 mL/min。檢測器為日本Shimadzu公司生產。

1.6 總酚類測定

采用普魯士藍法，具體參考文獻[10]。

1.7 發酵

發酵是在250 mL玻璃瓶中進行的。100 mL水解液接入發酵種子使細胞干重達到 2 g/L，并加入0.2 mL（24%）的尿素溶液。配好發酵栓，發酵在30 ℃進行。酒精生成量可以通過因 CO2的釋放引起瓶重變化監測，發酵液中酒精濃度最終由 HPLC測得，試驗重復3次。

1.8 計算

1 g葡萄糖理論上產生0.51 g酒精。酒精產量可以通過因CO2的釋放引起瓶重變化監測[11]。酒精產量= CO2減少量× 1.045

2 結果和討論

2.1 預處理后玉米秸稈水解液抑制劑組成

玉米秸稈經過預處理主要產生3類抑制劑——醛類、羧酸類和酚類。糠醛和5HMF 是主要的醛類抑制劑，由糖類降解生成。醛類物質會抑制醇脫氫酶及糖酵解酶的活性，從而影響酒精發酵。乙酸和甲酸是主要的羧酸類抑制劑，乙酸是由半纖維素中乙酸根基團水解形成，而甲酸是由糠醛和5HMF降解形成。由于 25 ℃乙酸的電離常數為4.76，未解離的乙酸與pH值有很大關系，會透過細胞膜影響細胞生長而產生抑制作用，研究表明維持相對較高的發酵pH值將會減輕乙酸的抑制作用。而酚類主要由木質素降解形成，目前已鑒別出來的酚類物質有幾十種，酚類物質能將細胞膜分化，從而影響膜的完整性，是微生物酒精發酵中最重要的一類抑制劑[12]。抑制劑的種類主要與原料及預處理條件有關，表1顯示了玉米秸稈經過濕熱預處理后水解液中主要抑制劑的含量。

2.2 脫毒后玉米秸稈水解液中抑制劑變化

采用中和法、飽和生石灰法和 Na2SO3法分別對玉米秸稈水解液進行了脫毒處理。從表2可以看出，抑制劑的去除與使用的脫毒方法有關。所使用的脫毒方法可以使醛類平均減少41%，最高的是采用Na2SO3法，可使醛類物質去除44.3%。而對于酚類物質，采用飽和生石灰法可得到 28.4%去除率。而 Na2SO3法則沒有效果。有趣的是中和法和飽和生石灰法一樣，能夠有效改變水解液中的醛類和酚類物質的含量。

表1 預處理后玉米秸稈水解液抑制劑組成

表2 脫毒方法對抑制劑的影響

2.3 不同脫毒方法對酒精發酵影響

利用樹干畢赤酵母（Pichia stipitis58376）對脫毒后的玉米秸稈水解液進行了酒精發酵實驗。以純葡萄糖和木糖組成的合成培養基（葡萄糖35 g/L，木糖0.5 g/L，24%尿素2 mL/L）作為空白對照。

表3展示了脫毒方法對酒精發酵的影響。受脫毒方法的影響，還原糖會有不同程度的損失。從圖1可以看到，3種脫毒方法都有效提高了酒精的得率。最佳的脫毒方法是飽和生石灰法，理論酒精得率達到69.31%，對應的酒精濃度和生產效率分別為12.2 g/L和0.056 g/(L·h)。根據報道木質素降解產物酚類更有毒性[13-14]，由于有效地去除了部分酚類物質和醛類物質，與其它方法相比，飽和生石灰法獲得了較高的菌體生物量，最終酒精含量較高。另外從圖2中也看到，盡管經過脫毒處理，水解液中的還原糖都沒有被P. stipitis完全利用，利用率在80%～90%之間，主要由于脫毒部分移去了抑制劑的緣故。

表3 脫毒方法對酒精發酵的影響

圖1 脫毒方法對酒精形成的影響

圖2 脫毒方法對還原糖消耗的影響

3 結 論

（1）經過濕熱預處理得到的玉米秸稈水解液，經過中和法、飽和生石灰法和Na2SO3法脫毒處理，可以使水解液中糠醛和5HMF平均減少41%，最高的是采用Na2SO3法，醛類物質去除率為44.3%。而對于酚類物質，采用中和法和飽和生石灰法可分別得到10.6%和28.4%去除率，而Na2SO3法則沒有效果。

（2）利用樹干畢赤酵母（Pichia stipitis58376）對脫毒后的玉米秸稈水解液進行酒精發酵，3種脫毒方法都有效提高了酒精的得率。最佳的脫毒方法是飽和生石灰法，理論酒精得率達到69.31%，對應的酒精濃度和生產效率分別為 12.2 g/L和 0.056 g/(L·h)。

（3）飽和生石灰法是一種有效實用的脫毒方法。為提高酒精得率，還可以進一步優化發酵工藝條件。

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Effect of different detoxification methods on ethanol production from corn stover hydrolysate

ZHANG Qiang1，Anders Thygesen2，Anne Belinda Thomsen2
（1School of Life Science and Technology，Changchun University of Science and Technology，Changchun 130022，Jilin，China；2Biosystems Division，Ris? DTU，Technical University of Denmark，Denmark）

The influence of three different detoxification methods（neutralization，overliming and Na2SO3addition）on inhibitors were evaluated by using corn stover hydrolysate prepared with hydrothermal pretreatment（195 ℃，15 min）. Ethanol fermentability of detoxified corn stover hydrolysate was investigated byPichia stipitis58376. The results showed that all the employed detoxification methods resulted in a 41% reduction in average total furans and highest 28.4% reduction in total phenols. Fermentation performance was greatly enhanced by employed detoxification methods.Ethanol yield of 69.31% of the theoretical value based on reducing sugar was obtained by overliming.The corresponding ethanol concentration and volumetric productivity were 12.2 g/L and 0.056 g/（L·h）.Overliming was the most efficient detoxification method.

corn stover；hydrothermal pretreatment；detoxification；Pichia stipitis

TK 6

A

1000-6613（2011）04-0739-04

2010-12-19；修改稿日期：2010-12-04。

吉林省教育廳科技項目（200623）。

及聯系人；張強（1969—），男，副教授，主要從事生物質能源的研究。E-mail corn11@126.com。